奥林巴斯共聚焦显微镜的非相干光源介绍

传统照明系统在现代视场显微镜利用透射光的卤钨源和荧光激发的短弧灯。各种激光器已在采用作为光源的视场观察几个调查员，在显微镜，共聚焦显微镜的出现大大增加使用激光。这种讨论评论的优点和局限性的非相干 （或非激光） 光源在共聚焦显微镜，作为共焦照明的光源和视场显微镜共聚焦显微镜在次要来源。Zui初的两个问题常常出现时的共聚焦显微镜的照明系统被认为是，和这些特定仪器光源的选择有直接的影响。

时选择系统组件，它是共同的问题是否可以在点扫描共聚焦显微镜中使用弧灯。虽然第一次共聚焦显微镜，建于 20 世纪 50 年代 （和 Marvin Minsky 1988 回忆录中讨论），采用锆弧在原型阶段扫描工具，短弧灯的光芒是太低，不能在现代点扫描共聚焦显微镜中有用。光辉考虑到源，其角发射的配置文件和光输出的大小。低发散、 甚至谦虚的激光从高辐射通量和小光斑大小，不能通过光束整形光学应用于电弧放电灯源。在图 1 中介绍的亮度图的等离子体球从汞 （HBO） 和 (XBO) 氙弧光放电灯。请注意两个来源的磁通密度的变化。

通常提出的第二个问题是适合用于纺纱磁盘共聚焦显微镜下，弧光放电灯，此应用程序是可能的虽然与局限性。再次，限制问题是此源类型的光辉。由于旋转磁盘共聚焦显微镜需要直径大的、 非常准直的、 统一的梁，同时照亮许多小孔，弧光放电灯有潜力成为适当的来源。受雇于当今纺纱磁盘文书 （通常 1-2%） 的尼普科夫磁盘的低传输需要相当大的输入的功率。一些旋转磁盘系统利用弧灯照亮 Nipkow 磁盘有相对较大的光圈，并出现了新的设计，增加光照强度。

从横河广泛使用的旋转磁盘扫描程序是利用激光光线由单模光纤耦合到扫描头。此外，安装在第二个磁盘上微透镜阵列与对齐在扫描仪中，增加励磁光收集关于针孔五倍相比，利用单个磁盘的设备。在扫描过程中的损失头光学、 波长选择过滤器和磁盘结果在激发光输出到后方孔径的只是大约 5%的在结束了光纤测量的目的。后方孔径所需的足够的信噪比在大多数生物应用程序Zui小辐照度是物镜的大约 40 微瓦每平方厘米，虽然可能利用达 120 微瓦每平方厘米。因此，约 5 毫瓦强度是需在光纤光纤输出。这种光的输出时在一些短弧灯的能力范围内，他们都通过多模光纤或液体光导耦合，如下所述。

非相干光源的特点

弧灯发射波长

在过去，Zui经常用于波长荧光激发了谱线产生的汞弧 （365、 405、 436、 546 和 579 纳米），如图 2 中给出。很多荧光团因此选择，使用，因为他们这些激烈的线条，兴奋和显微镜物镜被设计给同一波长Zui优修正。如可用激光波长往往不匹配汞发射谱线，利用激光共聚焦显微镜显微镜技术人员有时被被迫放弃使用熟悉荧光染料或激发他们在低于Zui佳波长。图 2 中所示是一个典型的 100 瓦特汞 （HBO 100） 和 75 瓦特 (XBO 75) 氙弧光放电灯的光谱辐照度概况作为波长的函数。汞灯展品在紫外和可见光区域，几个峰值，而氙弧灯提出了几乎连续的光谱非常小高峰 467 纳米和近红外区域的几个山峰。

汞和氙弧灯谱

超级压力氙弧光放电灯是经常需要时使用宽的激发波长范围。它的输出模拟太阳光，因为它提供了激烈宽带照明没有突出的谱线，在紫外光或可见光波长区域 （图 2）。压力扩大谱线匹配吸收谱的几种荧光染料，从而导致更有效的激励比从窄激光发射线能量相等。加宽的光谱线的可用性也允许同时激活的不同发射波长，包括那些在紫外线的几种荧光染料。

一致性

非激光光被区别于激光灯由其程度低得多的一致性。非相干光和相干光正在限制理论构造。在视场显微镜，很少关注的除了当考虑衍射和干涉效应的照明光的相干度。在实际意义上，光被认为是非相干时没有散斑效应是目前和相干的时候都。光源，事实上，展览空间相干源的角大小的关系和时间相干性，其波长的带宽有关。钨灯丝灯具有相对较低的空间相干性由于射极大。弧灯拥有更高的一致性，除非大面积的等离子体 （见图 1） 用来作为源。

一般情况下，具有低相干照明期望明视场和反射光学显微镜模式下，虽然是必需的阶段和干扰模式的光具有较高的一致性。荧光的过程涉及到足够数量的激发和发射照明光的相干性是通常并不重要，和从标本发出的光是基本上非相干之间的步骤。

如果照明光的相干性得太高，图像开发造成的从任何的光学表面，包括透镜、 反射镜、 灰尘 windows 和，尤其是盖板玻璃反射相干波波前的干涉条纹。这种复杂干扰模式可以显示为已定义的戒指，但更常见的是，它显示为高对比度的颗粒散斑，叠加后的图像，遮蔽的详细信息。此外，当试样是透明的有多层的显微组织，散斑点成为更复杂的人物。广谱灯照明具有低的时间相干性，和散斑平均。在大多数情况下，与低相干照明是常规和共聚焦显微镜更可取。另一方面，通过调整科勒照明系统，以减少源的有效大小，非激光光源还可以提供较高的一致性级别所需的干涉显微镜。

散斑效应是光明的如果在某一特定点周围的散射中心内从光的干扰是建设性与那从背景，和黑暗的如果破坏性干扰发生。明显的大小的散射中心和个别散斑与相关光学分辨率的限制 （或数值孔径）。在非相干光照明，散斑具有不同波长部分取消以产生一个较低的对比度模式之间重叠。由于散斑结果从干扰现象，任何的光学系统或标本的移动会导致在复杂变化的散斑图的时间。

光辉

光辉是光通量密度每单位固体可视角度衡量。它表示在瓦每平方厘米每球面度 （W/cm ^2/sr），并考虑到从来源、 其大小和角度分布的光通量辐射通量。光辉的来源的距离无关，因为采样的面积增加的比例。光度法等效措施是卑鄙的或经常表示在单位坎德拉每平方米的平均亮度 （cd/m ^2）。弧灯主要是弧的因为小相比灯灯丝的大小是弧的更加容光焕发比钨灯丝灯泡瓦数的几个数量级。钨灯丝灯泡可以有的细丝状，允许更有效的利用的光收集系统，和细丝经常弯曲成磁盘或宽而平的乐队来匹配输入的光收集光学孔径。弧灯从一个小的环面周围 （见图 1） 的两个电极之间的轴产生光。光收集系统需要的光源投射到试样不仅实现均匀照明的试样平面。

非相干光源的光学显微镜

表 1

表 1 比较常用的光源为视场光学显微镜。HBO 100 (100 瓦特高压汞弧光放电灯) 具有Zui高的光辉 （和平均亮度） 的常用任何的灯具瓦数，由于它非常小的源的大小。显微镜技术人员，为内容的光输出 （光谱辐照度）、 光谱是一个重要的考虑因素时比较各种来源。辐射通量是在所有波长的光输出的积分并不提供关于其光谱分布的信息。光度法的单位，如平均亮度，在使用时，这一点尤其明显。因为光度为单位进行加权根据人类的眼睛，输出中的紫外线或红外线的光谱敏感性有一个非常小的加权相比，这个绿色的光。辐射通量或光通量的多色和单色的来源 （如激光器和发光二极管） 之间的比较不是输出的有意义的如果只有有限的光谱部分的多色源是输出的将用于。

只有 47%的 HBO 100 盏灯的辐射输出介于 320 和 700 纳米的波长。大部分能量集中在著名的谱线在 366 毫微米 （大约总数的 10.7%） 436 纳米 （12.6%），546 纳米 （7.1%） 和 579 纳米 （7.9%）。可用输出从 XBO 75 （75 瓦特氙弧灯），虽然相对统一在 320 到 700 纳米的范围，构成了只有 24.5%的总额，与大部分落入的用处不在红外波长的能量 （约 73%的输出是在波长长于 700 纳米） 光谱区域。

XBO 75 (氙) 灯有光谱辐照度的大约 7 毫瓦每米平方每纳米 (mW/m ^2/nm ^1） （见图 2） 的 400 和 700 纳米之间。常规的 F/1 的镜子反射器球形收集器灯箱已收集效率的 12.5%，因此提供约 0.85 毫瓦每纳米可用光谱辐照度。因此，如果采用理想 20 纳米带通滤波器，交付的光通量在 20 纳米乐队将 17 毫瓦。如果使用集合镜子是椭圆的而不是球，它可以捕获来自四面八方的弧灯源，从而收集更大立体角内的光的总发射的光。65%的总所发出的光可以通过这样的系统，收集和辐射通量成大光圈 （大于 5 毫米) 增加达 7 倍相比普通的镜子反射器球形收集器。不幸的是，预计的射线束拥有黑暗中央点相应的金属结束了那盏灯，限制这盏灯在中使用类型系统的光源让液体光导 （进一步讨论如下） 人耦合到显微镜。

稳定性

通过加热的灯丝到一个更高的温度，可以提高亮度白炽灯源中的，但这也使金属崇高的更迅速，变暗的玻璃信封和导致灯丝烧坏。在石英卤素灯卤素气体通过与蒸发钨形成钨卤素化合物，然后分解当他们罢工对热丝的第一反应中断这一进程。这两个过程结合起来，有效地返回钨灯丝，和从而允许它运作，运作在较高的温度而变暗灯的信封，不合理的灯丝寿命。当由稳压的电源供电，在恒定的灯一致信封透明度结果输出级别，这是足够稳定，可用于光度测量。

一般情况下，弧灯是比白炽灯更不稳定，因为气体等离子体是不稳定和受影响的由磁场和由电极的侵蚀。强度的氙弧可深深地和迅速地调制在时间内保持电极冷却，正如在摄影电子闪光装置情况。或者，可以通过定期的磁场施加由转子的永久磁铁或由一个小的交变电流上主要直接励磁电流叠加可稳定等离子弧的位置。环绕的 HBO 100 弧部分加热线圈的另外允许电流通过灯可在很宽的范围内稳定输出强度的同时。

发光二极管

发光二极管 （Led） 组成非相干光源的特点，是有别于弧或钨灯丝灯泡独特的范畴。发光二极管产生连续光有效地从包裹中充当一个镜头清晰环氧树脂穹顶的简单双元件半导体二极管 （见图 3）。包括连接在芯片中的两个半导体地区之一就由负电荷 （n地区），和其他由正电荷 （p区）。当足够的电压对电机引线时，当前创建如电子进入跨交界处从n区p区域负电的电子在哪里与正电荷相结合。每个组合的收费是可能释放电磁能量以光子的形式量子的能量水平降低。发射光子的能量是半导体材料的特性，因此，不同的颜色通过在芯片的半导体组成的变化。

光子发光二极管的p-n结通常基于第三组和第五工作组的元素，如砷化镓、 磷化砷化镓和磷化镓的混合物。小心控制的这些化合物，并纳入铝和铟，以及掺杂碲和镁，此外的其他人的相对比例使制造商和研究人员能够生产二极管发出红、 橙、 黄色或绿色光 （见表 2）。这些排放量的带宽通常是与没有重要组成部分的红外或紫外波长 12 和 40 纳米之间。Zui近已允许使用的硅碳化物和氮化镓蓝光发射二极管来介绍，并结合几种颜色不同的组合提供了机制，产生白光。

如图 3 所示，光从侧面发光二极管半导体芯片的出现，和反映，期待的加入了一个电极 （负极） 的末日到了一杯同时顶部的芯片的脸与金接合线到第二电极 （阳极） 相连。典型的二极管半导体芯片的措施大约 0.25 毫米-广场和环氧树脂的身体范围从 2 到直径约 10 毫米。Zui常用的一种发光二极管灯的身体是圆的但它们可能是矩形、 方形或三角形。由二极管反射杯组合发出的光锥的角度可以通过改变环氧树脂透镜的形状，反光杯，和大小和半导体二极管和环氧树脂透镜的鼻子之间的距离的几何改变。清晰环氧树脂镜片产生的Zui高的光辉时它们的输出仅限于大约 15 度角。

发光二极管的颜色变化

表 2

虽然已有过去的努力采用发光二极管作为光源的显微镜，他们由于早期的设备的低辐射输出失败。以前专利的设计，显微镜的照明采用大量的分组，以建立一个统一模式的照明的 Led。这种方法产生更高的辐射通量，但未能解决的低的光芒，从这种大型的、 分布式的源的结果。目前天 Led 是足够明亮功能单独作为一种有效的单色光照射荧光或透射光镜观察。虽然其光谱辐照度仍低于从 HBO （汞） 100 弧灯，谱峰，它接近 XBO (氙灯) 75 可见光谱中的灯。

发光二极管是比弧光放电灯把电力转换成可见光，实现的达 100 流明每瓦特相比 22 流明每瓦特为 HBO 100 源的产出效率更高。指示灯坚固、 耐用，并可以常常Zui后 100000 小时在使用中或长于 HBO 100 约 500 倍。绿色指示灯可能具有转换效率高达 74%。紫色和蓝色 Led 光输出 250 和 150 毫瓦现商业上可用。发光二极管输出可能调制的高频率 （10 兆赫MHz） 和它们的输出亮度可能会受限制可使用的电流，消除机械百叶窗和中性密度滤镜在显微镜的应用需要的特点。

指示灯从根本上单色的排放国，并且高亮度、 单色灯是Zui广泛使用的设备当前这一代。有两种主要方法产生白色光从设备都是从根本上单色的。一种方法基于三种不同的二极管颜色在一个信封里或在单个 LED，输出将显示白色 ； 这种比例在不同的材料相结合另一种技术是利用紫罗兰色或紫外发光二极管为激发荧光粉发出白色的光 （如图 4 所示） 提供能量。

收集和中继试样的光

共聚焦显微镜的所有扫描机制雇用一个照明方法，即填充后方孔径的物镜。可用的光从光源耦合对标本是在非激光案例中，某种程度上更多地参与自源，例如弧灯辐射到一个球体，而不是生产平行光束。因此，反射器是圆弧的需要到直接的光从"背面"走向标本。不需要的波长，如红外线和紫外线，可以获准通过两色镜 （红外发射器是记为"冷镜"和"热镜"紫外线发射器），并被吸收在灯具外壳。由冷镜的散热减少了开源运动的机械和光学组件热膨胀引起的。必须适当地固定镜头附近热的来源，以便允许热膨胀。

柯勒照明是源的Zui常见的光学照明方案中透射和反射光镜因为它有助于均匀照亮图像字段从空间上复杂的源由成像只到焦平面的聚光镜 （或在 epi 照明的物镜后方焦平面） 上的一部分。光照射在试样为偶数，虽然这种光不可能到达，从所有可能的角度与平等的分配。字段孔径 （位于有效地在一个中间图像平面中） 被映像到限制的区域，而不会影响的角度的光线照明照亮的标本。对于高度非均匀的来源，扩压器可以用于进一步提高均匀性在焦平面上。柯勒照明不是效率Zui高的系统，因为它不会使用全表面的源或全角度分布的所发出的光。

柯勒照明系统的一个主要功能是确保均匀照明，控制其一致性 ；然而，它是可能实现使用一种光导的均匀照明。加扰的光，有效地降低其空间或时间的一致性，也被通过光导的应用。使用Zui广泛的和实际耦合方法的一种光源到显微镜下，同时也减少了一致性，是以将光线聚焦的灵活的单模式光纤或液体光导 （图 5） 长度。热运动中的液体光导不断改变光学路径和光线散射，以便有效地消除了空间和时间的一致性。

在挠性单模式光纤包层的反射的情况下不断改变，因为光纤弯曲略，生产在时间和空间有效均匀，强度有退出梁。据报振动频率达 100 千赫，纤维的技术能有效地光以及置乱。光的相位被炒由于不同的路径长度的光波通过纤维，虽然保存下来的高辐射率和单色性。退出梁由"高帽"强度的配置文件，而不是高斯光束分布的激光灯特点被描述。

为了避免可能的热损伤到光的扰码器，红外辐射，以及其他不需要的发射波长应删除之前他们输入的纤维或光指南。理想情况下，只有波长图像形成的关键应该离开的光源。而不是依赖宽带反射镜，冰冷的镜子和带通干涉滤光片应采用选择传送到孔径磁盘的光波长，以容许不必要的热量来逃避。

一个关键的问题是进入光纤耦合源灯的输出的效率。大多数纤维有数值孔径 0.2 至 0.55，之间，此值应与源集合光学匹配。几个制造商提供的灯室设计的实施与液体光导在其中满足此条件。在椭圆反射器、 冷的镜子和光学匹配的 3 到 5 毫米直径液体光导 75 瓦特氙弧的组合可以提供超过 2 毫瓦每纳米的光输出 （见图 5）。光纤端变得的有效光源的显微镜灯弧，从而减少在光辉相比，电弧本身的大小无关。然而，当物镜是光圈的均匀照明的使用大口径，在磁盘扫描共焦仪器情况一样，扩展的源是光圈的不损于性能。唯一的要求是准直透镜的直径足够大，以有效地收集输出从光导和投射到磁盘扫描程序。

旋转磁盘共聚焦显微镜光预算

表 3

表 3 总结了经验丰富的与非相干和相干照明横河纺纱磁盘共聚焦仪的典型结果。在这个特定的配置中，相干光照明系统包括通过声光可调谐滤光器 （AOTF） 耦合多线激光对单模式光纤。这种光纤的输出是 0.3 的数值孔径，扩大到一个均匀的光束直径 14.5 毫米并随后形高斯光束。通过一个路径，允许引进外部滤波器滑块或轮的波长选择镜像反映此扩的束。通过引入一个镜子和波长选择性的过滤，在筛选器滑块位置，就有可能从耦合到 XBO 75 灯安装在椭圆反射器液体光导介绍的扩大和准直的输出。要产生 20 毫米直径光束的光强均匀，用平凸透镜准直光纤的输出。横河共聚焦显微镜的标准红-绿-蓝 (RGB) 二向色镜允许三个波段，每个 20 纳米的带宽，将被传送。表 3 比较了到后方孔径的励磁蓝色光光谱区域 （488 纳米激光线和 470 490-纳米弧灯的输出） 这两个源的物镜的光通量。光通量值清楚地表明非相干源可以为此应用程序提供足够的能量。

充分利用旋转磁盘共聚焦显微镜中的多色源需要广泛的波长选择性过滤器和两色镜。虽然筛选器随时可用，横河仪器采用两色镜子是不寻常的设计，以及有限的可用性。目前，缺乏更大范围的适合两色镜可防止电弧源在此设备中充分利用。

审议的当前设备的光照属性指示发光二极管还会适合此旋转磁盘应用程序中。耦合单 LED 到多模光纤或液体光导是一个简单的问题，和随时可以通过定位 LED 在后方孔径的廉价低倍率物镜 （如 10 x 平场消色差） 对光夫妇到纤维。多数 LEDs 有输出带宽的 20-40 纳米，所以至少一半的光输出会通过二向色镜的 20 纳米带宽。基于前面所讨论的横河扫描仪中的光损失测量，约 1-2 毫瓦必须达到旋转磁盘，以实现所需的 40 微瓦每平方厘米在物镜后方光圈。因此，10 毫瓦单色输出发光二极管可能就足够了。然而，如果多色 LED 光源是必要的目前一天白色发光二极管缺乏的输出功率和均匀的光谱辐射亮度所需。

结论

非相干光照明来源很少使用在纺纱磁盘共聚焦显微镜，虽然Zui共焦仪器配备弧灯视场视觉观测的标本。审查的短弧灯的特点说明了适当旋转磁盘共聚焦显微镜可以有效地使用。此外，它很可能发光二极管将提供廉价、 寿命长、 稳定、 高效、 照明的视场和磁盘扫描共聚焦显微镜。