数码荧光显微镜使用过程中过滤不需要的荧光
Whitney L. Johnson , Aaron F. Straight , 细胞生物学方法, 2013
显微镜使用中减少不需要的荧光
来自感兴趣的 FP 以外的其他来源的荧光可能会掩盖相关的荧光信号。一些最常见的有害荧光来源是成像介质的添加剂。培养的细胞培养基通常含有 pH 指示剂，例如酚红荧光或血清成分，以及富含酵母和细菌的培养基也含有大量不需要的荧光。由于样品浸泡在成像介质中，即使是介质中微弱的荧光成分也会掩盖对所需荧光信号的检测。通常不可能排除所有有助于培养基荧光的成分；然而，使用不含添加剂的培养基（如酚红）或不含荧光成分的特定培养基可以消除重要的不需要的荧光来源。
不想要的荧光的第二个主要来源是样品本身的自发荧光。有许多具有内在荧光的细胞区室和组织的例子，例如胚胎中的卵黄血小板、植物中的叶绿体和真菌中的液泡区室等等。这些固有荧光源通常无法去除；然而，我们可以选择合适的滤光片就可以过滤掉它们。
荧光团在被称为光漂白的过程中被照射时会失去发荧光的能力。当荧光分子从荧光期间激发的电子累积化学损伤时，就会发生光漂白。光漂白会严重限制通过荧光显微镜观察样品的时间。有几种技术可以减少光漂白，例如使用更坚固的荧光团、通过最小化照明或使用光保护清除剂化学品。
带有荧光报告蛋白的荧光显微镜能够通过荧光显微镜分析活细胞，但是细胞容易受到光毒性的影响，尤其是短波长光。此外，荧光分子在光照下会产生反应性化学物质，从而增强光毒性效应。
与透射和反射光显微镜技术不同，荧光显微镜仅允许观察已标记为荧光的特定结构。例如，通过荧光显微镜观察用荧光 DNA 染色剂制备的组织样本只能揭示细胞内 DNA 的组织结构，而不能揭示细胞形态的其他信息。
建议从非荧光图像（例如明场）估计荧光信号的计算技术可以减少这些问题。[8]一般来说，这些方法涉及在染色细胞上训练深度卷积神经网络，然后估计未染色样品上的荧光。因此，通过将研究中的细胞与用于训练网络的细胞解耦，成像可以更快地进行并且光毒性降低。