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　　南隐士编着

　　第一节 产业发酵染菌的危害

　　发酵工业自从采取纯种培养以后，产率有很大进步，然而，防止染菌的请求也更高了。人们在与杂菌污染的奋斗中，积聚、总结了很多可贵的经验。为了防止染菌，应用了一系列的设备、工艺和管理措施。例如：密闭式发酵罐，无菌空气制备，设备、管道和无菌室的设计，培养基和设备灭菌，培养过程及其他方面的无菌操作等，大大下降了染菌率。但是至今一些现代发酵产业还遭遇染菌的严重要挟，甚至由于染菌而造成宏大的经济丧失。

　　据报道, 国外抗生素发酵染菌率为2％～5％，国内的抗生素发酵、青霉素发酵染菌率2％，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率约为5％，谷氨酸发酵噬菌体沾染率1～2％。染菌还是发酵产业的致命伤。轻者影响产率、产物提取收得率和产品德量；严重者造成“倒罐”，挥霍大批原资料，造成严重经济丧失，而且捣乱生产秩序，损坏生产打算。碰到持续染菌，特殊是又找不到染菌原因，未有防治办法时，往往会影响人们的情感和生产积极性，造成无法估计的迫害。

　　染菌对发酵产率、提取收得率、产品德量和三废治理等都有很大影响。然而，生产不同品种，污染不同种类和性质的杂菌，不同的污染时间，不同的污染道路、污染水平，不同培养基和培养条件，所发生成果是不同的。

　　1、染菌对不同品种发酵的影响

　　由于各种发酵的菌种、培养基、发酵条件、发酵周期以及产物性质等不同，受污染的迫害水平也不同。

　　青霉素发酵，由于很多杂菌都能发生青霉素酶，当青霉素发酵无论是在前期、中期或后期沾染都能发生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素敏捷损坏，使发酵一无所获。

　　疫苗深层培养，一旦受污染，无论污染的是活菌、逝世菌或内外毒素，都应全体放弃。

　　柠檬酸发酵，在产酸后，pH值很低，一般杂菌不易生长，柠檬酸重要防止前期染菌。

　　谷氨酸发酵周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰硕，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的要挟非常大。

　　肌苷、肌苷酸发酵，由于生产菌是多种营养缺点型，生长才能差，培养基营养丰盛等，容易受杂菌污染，且杂菌污染后，营养成分迅速被消费，严重抑制生产菌生长和代谢产物的生成。

　　然而，无论哪种发酵，染菌后都由于糖等基质被耗费，影响发酵产物的天生，使产量大为下降。

　　2、感染不同种类和性质的杂菌对发酵的影响

　　抗生素发酵中，青霉素发酵污染细短产气杆菌比污染粗大杆菌伤害更大，链霉素发酵污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌更危害，四环素发酵Zui怕污染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌。

　　柠檬酸发酵Zui怕污染青霉菌。肌苷、肌苷酸发酵Zui怕污染芽孢杆菌。谷氨酸发酵Zui危险的是污染噬菌体，由于噬菌体蔓延迅速，难以防治，容易造成连续污染。

　　3、不同污染时光对发酵的影响

　　（1）种子培养期染菌

　　（2）发酵前期染菌

　　（3）发酵中期染菌

　　（4）发酵后期染菌

　　(1)种子培养期染菌

　　种子培养重要是生长滋生菌体，菌体浓度低，培养基营养丰盛，比拟轻易染菌。种子培养期染菌，带进发酵罐中伤害极大，应严厉把持种子污染。当发明种子受污染均应灭菌后弃往，并对种子罐、管道进行检讨和彻底灭菌。

　　(2)发酵前期染菌

　　发酵前期主要是菌体生长滋生，代谢产物天生很少，这个时代轻易染菌，污染后杂菌敏捷繁殖，与生产菌争取营养成分和氧分，严重干扰生产菌的生长繁殖和产物的天生，要特殊防止发酵前期染菌。当发酵前期染菌时，由于营养成分消费未几，应迅速重新灭菌，弥补必要的营养成分(如果体积太大，可放出部分受污染发酵液）重新接种进行发酵。

　　(3)发酵中期染菌

　　发酵中期染菌将严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。有的杂菌繁殖后产生酸性物资，pH值降落，糖、氮消费迅速，菌(丝)体自溶，发酵液发粘，产生大批泡沫，代谢产物的积聚迅速减少或结束，有的已生成的产物也会被应用破坏，有的发酵液发臭。

　　由于发酵中期染菌，养分成分大批耗费，一般抢救处理艰苦，迫害性很大。所以，发酵中期染菌应努力做到早发明，快处置。处置方式应依据各种发酵的特色和具体情形来决议。

　　如：抗生素发酵，可将另一罐发酵正常、单位高的发酵液的一部分输入染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，同时采用低透风，少流加糖；柠檬酸发酵中期染菌，可根据所染杂菌的性质分辨处理，如污染细菌，可加大透风量，加速产酸，下降pH值，以抑制细菌生长，必要时可参加盐酸调节pH3.0以下，抑制杂菌；如污染酵母，可参加O.025～O.035 g／L硫酸铜，抑制酵母生长，并进步风量，加速产酸；如污染黄曲霉，可加入另一罐将近发酵成熟的醪液，使pH值降低,使黄曲霉自溶；但污染青霉则危害很大，由于青霉在pH值很低下能够生长，如果残糖较低，可以提高风量，促使产酸和耗糖，提前放罐。

　　(4)发酵后期染菌

　　发酵后期产物积聚较多，糖等养分物资接近耗尽。假如染菌量不太多，可持续进行发酵；如污染严重，损坏性较大，可以采用办法提前放罐。

　　发酵后期染菌对不同产物的影响不同，如抗生素、柠檬酸发酵后期染菌影响不大，而肌苷、肌苷酸和谷氨酸、赖氨酸等发酵后期染菌会影响产物的产量、产物提取和产品质量。

　　在染菌严重时，有人主意加入不影响生产菌正常代谢的某些抗生素、呋喃鲁西林、对苯二酚、新洁尔灭等灭菌剂、克制杂菌生长。例如：庆大霉素发酵染菌，可参加少量庆大霉素粉或对苯二酸；灰黄霉素发酵染菌时，可加进新霉素。但是，在发酵开端时都加入杀菌剂以防止染菌，似无必要，也增添本钱，若当发酵染菌后再加入杀菌剂又为时已晚，实际后果值得探讨。

　　4、染菌水平对发酵的影响

　　染菌程度愈太，即进入发酵罐的杂菌数目多，对发酵的危害愈大。当生产菌已迅速繁殖，在发酵液中占领上风，污染极少数杂菌，如每1L中有1～2个杂菌，对发酵不会带来影响，由于这些杂菌须要时间繁殖才干达到危害发酵的程度，而且环境对杂菌的繁殖已不利。当75m3发酵液污染1个杂菌，要达到大幅度(106个／mL)污染时需要的时间(h)为：

　　条件 污染10000000个／mL 污染100000000个／mL

　　增代时光tg=30 min 23 26

　　延迟6h tg=30min 29 32

　　增代时光tg=2h 92 10000000

　　延迟6h tg=2h 98 11*11

　　但是污染幅度较大时，特别是发酵前期和中期污染，将造成严重的伤害。

　　5、染菌对产物提取和产品德量的影响

　　对于丝状菌发酵被污染后，有大量菌丝自溶，发酵液发粘，有的甚至发臭。发酵液过滤困难，发酵前期染菌过滤更艰苦，严重影响产物提取收率和产品质量。在这种情形下可先将发酵液加热处理，再加助滤剂或者先加絮凝剂，使蛋白质凝集，有利于过滤。

　　染菌的发酵液含有较多蛋白质和其他杂质：（1）如果采用沉淀法提取产物，那么，这些杂质随产物沉淀而影响下工序处理，影响产品质量。如谷氨酸发酵染菌后，在等电点呈现β-型结晶，使谷氨酸无法分别，β-结晶谷氨酸含有大量发酵液，影响下工序精制处理，影响产品质量。（2）如果采用溶媒萃取的提取工艺，由于蛋白质等杂质多，极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分别，也影响进一步提纯。（3）如果采用离子交流法提取工艺，由于发酵液发粘，大量菌体等胶体物资粘附在树脂表面或被树脂吸附，使树脂吸附才能大大降低，有的难被水洗掉，在洗脱时与产物一起被洗脱，混在产物中，影响产物的提纯。

　　此外，发酵染菌也造成三废处理艰苦和对环境的污染。

　　第二节 染菌的检查、原因分析和防止措施

　　1、染菌的检讨与断定

　　在发酵进程中，对杂菌污染的及早发明、及时处置，是免除染菌造成严重丧失的主要办法。因此，请求有确实、敏捷的方式来检出杂菌的污染，目前常用办法重要有以下几种。

　　（1）显微镜检查

　　（2）平板划线培养或斜面培养检查法

　　（3）肉汤培养检查法

　　（4）异常现象断定法

　　（l）显微镜检查

　　通常用革兰氏染色法，染色后在高倍显微镜下察看。对于霉菌、酵母发酵，先用低倍镜视察生产菌的特点，然后再用高倍镜察看有否杂菌存在。依据生产菌与杂菌的特点差别，判定是否染菌。必要时，可进行芽孢染色和鞭毛染色。

　　（2）平板划线培养或斜面造就检讨法

　　先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱37℃，保温12h ，检查无菌即可使用。将须要检查的样品在无菌平板上划线，分辨置3℃、27℃培养，以适应嗜中平和低温菌的生长，一般在8 h后即可视察。 噬菌体检查可采用双层平板培养法，底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量。先将灭菌的底层培养基熔后倒平板，凝固后，将上层培养基熔解并坚持40℃，加生产菌作为唆使菌和待检样品混杂后迅速倒在底层平板上，置培养箱保温培养，经12-20 h培养，视察有无噬菌斑。

　　培养基(pH 7．O)

　　葡萄糖(%) 牛肉膏(％) 蛋白胨(％) NaCI(％) 琼脂(％)

　　上层 O.5 l.O 1.O O.5 1.0

　　下层 O.5 1.O 1.O O.5 2.O

　　(3)肉汤培养检查法

　　将需检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置37℃和27℃．分辨培养24h，进行察看，并取样镜检。此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时应用生产菌作为唆使菌。

　　葡萄糖酚红肉汤培养基：牛肉膏0.3％，葡萄糖0.5％，氯化钠0.5％，蛋白胨0.8％，1 %酚红溶液0.4％，pH 7.2。

　　无菌实验仅取样几毫升，平板划线培养取样更少，当发酵罐污染菌量未几。 例如，每1 ml发酵液污染1个杂菌时被发现(一般检出染菌时已超过这数目)，如果发酵液为35m3，即污染的总菌数为35|×106个。假定发酵开端时污染1个菌，繁殖至35×106个需要的时间如下。

　　设杂菌生长世代时间为1／2 h，生长速率常数μ为：

　　则从1个菌滋生至35×l0000000个所需的时间：

　　盘算成果表明，35m3发酵液从污染1个菌至35×10000000个菌需要12.5 h。也就是污染1个菌到能被检出需要12.5 h。因此，用以上的检查方法检查未发现污染，还不能确定未被污染。

　　除以上办法外，还可以从发酵过程的异常现象来判定是否染菌，如溶解氧、 pH值、排气中CO2含量和菌体酶活气等变化来判定。

　　（4）发酵过程中的异常现象判定法

　　（A） 溶解氧程度异常变化显示染菌

　　（B） 排气中C02异常变更显示染菌

　　(A)溶解氧水平异常变化显示染菌 好气性发酵均须要不断供氧，特定的发酵具有一定的溶解氧水平，而且在不同发酵阶段其溶解程度不同。图6一l为谷氨酸异常发酵和异常发酵的溶解氧水平曲线。在发酵初期，菌体处于适应期，耗氧量很少，溶解氧基础不变；当菌体进入对数生长期，耗氧量增添,溶解氧浓度很快降低，并且保持在一定水平(5％饱和度以上)，这阶段由于操作条件（pH、温度、加料等）变化。溶解氧有波动，但变化不大;发酵后期，菌体朽迈，耗氧量减少，溶解氧浓度又上升。当感染噬菌体时，生产菌的呼吸作用受克制，溶解氧浓发很快上升，如图中虚线所示。从图中可见感染噬菌体时，溶解氧的变化比菌体浓度变化更敏锐，能更快地预感受感染。污染杂菌时，由于所感染杂菌的好氧性不同而异，当污染好气性杂菌，溶解氧在较短时间降落，并且接近零值，且长时间不能回升；当污染的是非好气性菌，而生产菌又由于受污染而克制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。

　　(B)排气中C02异常变更显示染菌

　　好气性发酵排气中CO2含量与糖代谢有关，可以根据。CO2含量来把持发酵工艺（如流加糖、透风量等）。对于某种发酵，在工艺必定时，排气中C02含量变化是有规律的。在染菌后，糖的耗费产生变更(加快或减慢)，引起CO2含量的异常变化。如污染杂菌，糖耗加快，C02含量增添；沾染噬菌体，糖耗减慢，CO2含量减少。因此，可依据CO2变化来断定染菌。

　　2、发酵染菌率和染菌原因剖析

　　（1）发酵染菌率

　　发酵的总染菌率是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比，

　　总染菌率 =（发酵染菌批数/总投料批数）×100％

　　发酵染菌率是在发酵罐中产生的染菌率，包含染菌后被抢救不了导致倒罐的批数，但种子罐培育的染菌不接进发酵罐，不导致发酵染菌的另行盘算。

　　由于各种发酵的菌种、培育基、产品性质、发酵周期、生产环境条件、装备和治理技巧程度等不同，染菌率有很大差异。如抗生素发酵周期长，养分比拟丰盛，染菌率较高。

　　据报道美国抗生素发酵，50年代染菌率为5％，随着技术水平提高，染菌率降低但现仍然有2％。1979年瑞典Asfra公司报道，世界抗生素发酵染菌率为1％～10％，大多数公司染菌率为2％～5％。国内青霉素发酵染菌率低乎2%，链霉素、四环素、红霉素发酵染菌率均高于5％。国内谷氨酸发酵主要感染噬菌体，70年代有的厂家感染率高达10％，近年来由乎管理技术水平提高，已降低于2％以下。

　　（2）染菌原因分析

　　在发酵染菌之后，必需剖析染菌原因，总结发酵染茵的经验教训，把发酵染菌消灭在产生之前，防患于未然，是积极制服发酵染菌的Zui主要措施。假如对染菌不作具体分析。不懂得原因，而盲目地采用“措施”，只会劳民伤财，毫无后果。

　　造成发酵染菌的原因很多，但总结回纳起来，其主要原因有：

　　（A） 种子带菌；

　　（B） 无菌空气带菌；

　　（C） 设备渗漏；

　　（D） 灭菌不彻底；

　　（E） 操作失误和技巧管理不善。

　　表6.1为日本抗生素发酵1965年染菌原因分析，表6.2为国内抗生素厂发酵染菌原因分析。在发生染菌后，根据无菌实验成果，参考以下方法进行分析，找出原因，杜尽污染。

　　表6?1 日本抗生素发酵染菌原因分析(1965年前)

　　染菌原因 百分率(％) 染菌原因 百分率(％) 种子带菌或猜忌种子带菌

　　接种时罐压跌零

　　培养基灭菌不彻底

　　空气系统有菌

　　夹套穿孔

　　搅拌填料漏

　　泡沫冒顶 9.64 0.19 O.79 19.96 12.36 2.09 O.48 阀门渗漏

　　蛇管穿孔

　　罐盖漏

　　接种管穿孔

　　其它设备漏

　　操作同题

　　原因不明 1.45 5.89 1.54 O.39 10.13 10.15 24.91 表6-2上海第三制药1961年3～10月染菌原因剖析 染菌原因 百分率(％) 染菌原因 百分率（%) 种子带菌 14.15

　　蛇管穿孔

　　阀门渗漏 23.3

　　空气体系有菌 10.0 14.20 治理不善 25.08

　　其它

　　原因不明 7.49 5.00 (a)染菌时间

　　发酵早期染菌，可能原因有：种子带菌，培育基或装备灭菌不彻底，接种操作不当，无菌空气带菌等；

　　发酵后期染菌，可能原因有：中间补料污染，设备渗漏,操作问题。

　　(b)污染的杂菌种类

　　污染耐热的芽孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底；污染球菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌，可能是种子带菌、设备渗漏、操作问题等；污染浅绿色菌落的杂菌，可能是起源于水，即冷却盘管掺漏;污染霉菌一般是无菌室灭菌不彻底或操作问题。

　　(c)染菌的幅度

　　如果各个发酵罐或多数发酵罐染菌。而且所污染的是同一种杂菌，一般是空气体系问题；假如个别罐持续染菌，一般是设备问题。

　　以上仅仅是在分析问题时作为斟酌问题的入门，应根据具体情形综合分析，且通过进一步的无菌检查来验证。

　　3、杂菌污染道路及预防

　　（1） 种子带菌及防止

　　（2） 无菌空气带菌及防止

　　（3） 培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防止

　　(1)种子带菌及防止

　　种子带菌的原因主要有以下几方面。

　　(a)培养基及用具灭菌不彻底菌种培养基及用具灭菌均在杀菌锅中进行，造成灭菌不彻底主要是灭菌时锅内空气排放不完整，造成假压，使灭菌时温度达不到要求。

　　(b)菌种在移接进程中受污染菌种的移接工作是在无菌室中，按无菌操作进行。当菌种移接操作不当，或无菌室管理不严，就可能引起污染。因此，要严格无菌室管理制度和严厉按无菌操作接种，公道设计无菌室。

　　(c)菌种在培养过程或保躲过程中受污染菌种在培养过程和保藏过程中，由于外界空气进入，也使杂菌进入而受污染。为了防止污染，试管的棉花塞应有一定的紧密度，不宜太松，且有必定长度，培养和保躲温度不宜变化太大。每一级种子培养物均应经过严厉检查，确认未受污染才干应用，

　　(2)无菌空气带菌及防止

　　无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。杜尽无菌空气带菌，必需从空气净化流

　　程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和治理等方面完美空气净化

　　体系。

　　(3)造就基和设备灭菌不彻底导致染菌及防止

　　培养基和设备灭菌不彻底的原因，主要与以下几个方面有关。

　　(a)原料性状

　　一般稀薄的培养基轻易灭菌彻底，而淀粉质原料，特殊是有颗粒时，容易灭菌不彻底，造成染菌。淀粉质原料在升温过快或混杂不均匀时，容易结块，使团块中心部位“夹生”，包埋有活菌，蒸汽不易进进将其杀灭，在发酵过程中团块散开，导致染菌。因此，淀粉质培养基灭菌以采取实罐灭菌为好，在升温时先搅拌混杂均匀，并加必定量α一淀粉酶使边加热边液化，有大颗粒的原料应经过筛除往。

　　(b)实罐灭菌时未充足消除罐内空气

　　实罐灭菌时，罐内空气未完整消除，造成“假压”，使罐顶空间局部温度达不到灭菌请求，导致灭菌不彻底而污染。为此，在实罐灭菌升温时，应打开排气阀门及有关联接收的边阀、压力表接收边阀等，使蒸汽通过，到达彻底灭菌。

　　(c)培养基持续灭菌时未到达灭菌温度

　　培养基连续灭菌时,蒸汽压力波动大，培养基未到达灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染。培养基连续灭菌应严格节制灭菌温度，Zui好采取主动把持装置。

　　(d)设备、管道存在“死角”

　　由手操作、装备构造、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效达到或不能充足达到预定应当达到的局部灭菌部位，从而不能达

　　到彻底灭菌的要求。这些不能彻底灭菌的部位称为“死角”，“死角”可以是设备、管道的某一部位，也可以是培养基或其他物料的某一部分。

　　常见的设备、管道“逝世角”有以下几方面：

　　①发酵罐的“死角”

　　②管道安装不当形成的“死角”

　　①发酵罐的“死角”

　　发酵罐内的部件及其支持件，如拉手扶梯、搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、档板、空气散布管及其支持件、温度计套焊接处等四周容易积集污垢，形成“死角”。加强清洗并定期革除污垢，可以排除这些“死角”。

　　发酵罐制造不当造成“死角”。如不锈钢衬里焊接质量不好，导致不锈钢与碳钢之间有空气，在灭菌时，由于三者膨胀系数不同，使不锈钢鼓起或决裂，造成“死角”(见图)。

　　罐底部堆积造就基中的固体物，形成硬块，包躲着脏物(图)，使灭菌不彻底。应增强清洗，打消积垢。

　　罐底的增强板长期受紧缩空气顶吹而腐化，受损或裂痕；或焊接不当，造成灭菌不彻底(图6-4)。应煅成与罐底雷同弧度，使之吻合紧密，并注意焊接质量。

　　发酵罐封头上的人孔(或手孔)、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口．压力表接口等都是造成“死角”的潜在之处。一般应安装边阀，使灭菌彻底，并注意清洗。

　　②管道安装不当形成的“死角”

　　发酵车间的管道大多数以法兰衔接，法兰的加工、，焊接和安装要符合灭菌要求，务使连接处两节管道畅通、光滑、密封性好，垫片内圆恰与法兰内径相等，安装时须对准中心。热片内径太大、太小或安装不对准中心，都会造成“死角”(图a、b)。法兰与管子焊接不好，受热不均匀，易使法兰翘曲，密封面不平，显微镜价格摄像头价格，形成“死角”(见图c)。

　　某些管道须在发酵进程中或在培养基灭菌后才进行灭菌，如种子罐底部的移种管，如安装不当，就会存在蒸汽不易通达的“逝世角”(图 a)。打消方式见图b。

　　压力表安装不公道会形成“死角”(图6a)，打消办法是在近压力表处安装放汽边阀(图 b)。

　　（4）设备渗漏引起染菌及防止

　　发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐化、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏。例如：设备的表面或焊缝处如有砂眼，由于腐化逐渐加深，终极导致穿孔；冷却管受搅拌器作用，长期磨损，焊缝处受冷热和振动产生裂痕而渗漏。

　　为了避免设备、管道、阀门渗漏，应选用优质的资料，并经常进行检查。冷却蛇管的渺小渗漏不易被发现，可以压入碱性水；在罐内可疑处所，用浸湿酚酞唆使剂的自布擦，如有渗漏时白布显红色。。

　　（5）操作问题

　　上面已指出，在菌种培养过程中，如操作不当会引起染菌。在发酵过程如操作不当也会引起染菌，如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；紧缩空气压力忽然降落，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等。

　　防止操作失误引起染菌，要增强对技术工人的技巧培训和义务心教导，进步工人素质，强化管理措施。

　　


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