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　　 【摘要】 目标 探讨声敏剂血卟啉对COC1/DDP细胞顺铂敏感性的影响及其机制。方法 将人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP分为A、B、C、D 4组（分辨为对照组、单纯顺铂组、血卟啉+超声组、顺铂+血卟啉+超声组）,视察各组处理后癌细胞的增殖、细胞克隆形成情形,联合用药后果及bcl2和bax表达的变更。结果 D组COC1/DDP细胞增殖抑制明显,细胞凋亡率升高,均与其他组差异有统计学意义（P<0.05）,bcl2蛋白阳性表达率在C、D组显着降


　　低(P<0.05),A、B组差异无统计学意义(P>0.05)。bax蛋白阳性表达率在各组表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 声动力疗法联合顺铂能有效地加强对耐药卵巢癌细胞的杀伤才能,减少癌细胞的天生。

　　【症结词】 卵巢癌; 声动力疗法; 血卟啉; 顺铂

　　A Discussion on Effect and Mechanism of Haematoporphyrin to Chemotherapy Sensitivity of Cisplatin on COC1/DDP

　　ZHOU Xiaoli1,TANG Liangdan2,WANG Yan1,PENG Liqin1

　　(1.Department of Gynecology,Maternal and Child Health Hospital of Leshan City,Sichuan Leshan 614000,China;2.The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

　　【Abstract】 Objective To determine whether sonodynamic treatment (SDT) can enhance chemotherapy effect of cisplatin on ovarian cancer cells. Methods Drug resistance ovarian cancer cells COC1/DDP were divided into 4 groups randomly:cisplatin (DDP)group,haematoporphyrin(Hp)+ Ultrasound group，奥林巴斯,cisplatin(DDP)+ haematoporphyrin(Hp)+Ultrasound group and control group.Cell proliferation,apoptosis,protein bcl2 and bax expression were observed.Results In DDP+ Hp+Ultrasound group,cell proliferation was greatly inhibited,COC1/DDP cell clone efficiency was the lowest(P<0.05).Bcl2 expression in Hp+ Ultrasound group and DDP+Hp+ Ultrasound group deceased significantly (P<0.05),while there were no obvious difference in control goup and cisplatin group.We did not observe great difference in protein bax expression in any group (P>0.05). Conlusion SDT could effectively enhance cell killing ability of cisplatin on drug resistance ovarian cancaer cells.

　　【Key words】 ovarian caner; sonodynamic treatment; haematoporphyrin; cisplatin

　　卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖体系Zui常见的恶性肿瘤之一,也是妇科肿瘤中预后Zui差的癌症,除了难以早期发明外,化疗耐药是卵巢癌治疗失败的重要原因之一。铂类药物为主的联合化疗是目前卵巢癌的一线化疗计划,患者5年生存率一直彷徨在30 %左右。化疗耐药的发生被以为是引起生存率降低的重要原因之一,严重影响了卵巢癌患者的化疗疗效和生存质量。化疗耐药是多因素、多道路共同作用的成果,抗癌药物诱导细胞凋亡受阻是其主要机制之一。因此,寻找一种新兴治疗理念逆转耐药或者直接灭活耐药卵巢癌细胞是医学工作者亟待解决的要害问题,更是肿瘤康复中进步女性生产率和改良女性生涯质量的急切须要。声动力疗法（SDT）是一种很有利用远景的治疗肿瘤的办法。大批研究表明,超声加血卟啉(hematoporphyrin,Hp)比单独超声对肿瘤细胞更具有杀伤后果,血卟啉则无抗肿瘤效应［1,2］。有报道说这种杀伤作用机制是通过引诱细胞凋亡［3］。在本实验中,作者把超声激活的血卟啉联合顺铂作用于人卵巢癌顺铂耐药细胞,察看其杀伤的作用,以期降低卵巢癌对顺铂化疗的耐药。

　　1 资料、仪器与方式

　　1.1 资料

　　1.1.1 试剂和仪器 超声增敏剂血卟啉购自Sigma公司,注射用顺铂购自齐鲁制药有限公司（国药准字H37021358）,四甲基偶氮唑蓝（MTT）、姆萨色素为Sigma公司。血卟啉和MTT均以生理盐水配成5 mg/ml的溶液,过滤除菌后4 ℃避光保留。超声装置为陕西师范大学声学研究所研制,探头面积为4.7 cm2.

　　1.1.2 细胞系及培养 肿瘤细胞株为人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP（购自中科院上海细胞生物学研究所）。COC1/DDP在含有0.5 μg/ml顺铂的完全培养基（50 μg/ml青霉素,50 μg/ml链霉素和10 %胎牛血清的RPMI 1640细胞培养基）37 ℃,5 % CO2惯例细胞培养、传代。实验前1周换用不含顺铂的完全培养基培养。

　　1.2 方式

　　1.2.1 MTT法检测各实验组对COC1/DDP细胞增殖的影响 把细胞制成单细胞悬液,以每孔0.2×104个接种于96孔板中,每孔200 μl完整造就基。12 h落后行试验干涉,按以下分组进行实验干涉,A组(对照组):单纯造就COC1/DDP细胞;B组(单纯顺铂组):在细胞中加进顺铂,顺铂选0.625、1.25、2.5、5 μg／ml 4个浓度;C组(血卟啉+超声组):血卟啉选0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg/ml 4个浓度,同时进行超声照耀60 s;D组(顺铂+血卟啉+超声组):细胞液中参加顺铂和血卟啉,使其终浓度分辨为0.625、1.25、2.5、5 μg／ml和0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg/ml,同时进行超声照耀60 s.每组设5个复孔,此时记为0 d;于37℃、5 % CO2的饱和湿度箱中持续培育和察看,于3 d后取出 96孔板,1 200 r/min离心10 min.往上清,参加180 μl完整造就基和20 μl MTT,37 ℃持续培育4 h,离心后警惕吸弃上清。再加进150 μl DMSO,振荡10 min,充足溶解。选择490 nm,在酶标仪测定各孔吸光率。实验反复3次。按下列公式求出增殖抑制率:肿瘤细胞增殖克制率=［1(药物处置组OD值空白对比组OD值)／(细胞对照组OD值空缺对照组OD值)］×100 ％.

　　1.2.2 PI/Hoechst染色检测细胞凋亡情形 细胞生长达80 %融会时消化传代,以每孔0.3×104个接种于96孔板中,每孔200 μl完整培育基。12 h落后行实验干涉,分组同前,72 h后,每孔依次参加细胞染色缓冲液100 μl、Hoechst染色液0.5 μl、PI染色液0.5 μl冰浴30 min,PBS洗涤1次,再在荧光显微镜下察看。计数凋亡细胞比例。

　　1.2.3 免疫细胞化学检测实验干预后COC1/DDP细胞内bcl2和bax表达的变更 选取对数生长期的COC1/DDP细胞,制成单细胞悬液,按2×104/ml接种于24孔培养板,继续培养12 h后按前述办法进行分组处置。各组细胞经实验处置后置于37 ℃,5 % CO2孵箱中持续培养8 h,收集细胞,涂布细胞于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上,室温风干,纯丙酮室温固定30 min.按免疫组化试剂盒应用阐明书分辨进行:纯甲醇加过氧化氢至0.5 %,室温30 min以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗涤后，滴加免抗bcl2(或bax)基因抗原的抗体,置湿盒中37℃,20 min,0.01 N PBS洗2 min×3次后，滴加生物素化羊抗兔IgG,置湿盒中37℃,20 min.0.01 N PBS洗2 min×3次后滴加SABC 37 ℃,20 min,0.01 N PBS洗5 min×4次后，DAB显色10 min,蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。光学显微镜下视察细胞浆着色呈棕黄色的为阳性细胞,每张片随机计数3个视野,每样品取5张片的均匀值为阳性表达率。

　　1.3 统计学方式

　　所获实验数据均以均数±尺度差(±s)表现,采取SPSS 12.0统计软件进行单因素方差剖析,进行单因素方差剖析和明显性检验。预先用Homogeneity of Variances进行方差齐性检验,如方差齐采取LSD检验,如方差不齐采取TamhaaeT2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MTT法检测各试验组对COC1/DDP细胞增殖的影响

　　顺铂、血卟啉、顺铂和血卟啉联用对COC1/DDP细胞增殖的影响（见表1、2）,两种办法联用的增殖抑制率随着各自浓度的增长而增添,各组与对照组差异有统计学意义(P<0.01)。表1 顺铂和血卟啉联合作用下COC1/DDP细胞的细胞增殖MTT实验OD值表2 顺铂和血卟啉联合作用下COC1/DDP细胞的增殖抑制率

　　2.2 顺铂和血卟啉联合利用对COC1/DDP细胞凋亡的影响

　　顺铂组和血卟啉组的凋亡率高于空缺对比组,其差别具有统计学意义(P<0.05);血卟啉＋顺铂组与血卟啉组和顺铂组相比,其凋亡率高于血卟啉组温柔铂组,其差异均有明显性(P<0.05)。提醒血卟啉温柔铂都对COC1/DDP细胞有增进凋亡的作用,而且血卟啉和顺铂联用能够增强这种促进作用(见表3、图1)。表3 顺铂和血卟啉结合作用下COC1/DDP细胞的凋亡率

　　2.3 免疫细胞化学检测实验干预后COC1/DDP细胞内bcl2和bax表达的变更

　　bcl2免疫组化染色光学显微镜下视察到空缺对照组和顺铂组中可见很多细胞内胞浆呈棕黄色,高倍镜下可见胞浆内有大批棕黄色颗粒,而血卟啉+超声组和顺铂+血卟啉+超声组此种细胞显明减少。Bax蛋白的免疫组化染色可见在血卟啉+超声组温柔铂+血卟啉+超声组中有较多的胞浆呈棕黄色颗粒的细胞,而对照组和顺铂中的此种细胞较少,bcl2蛋白及bax表达阳性率（见表4）。统计剖析结果表明:血卟啉+超声组和顺铂+血卟啉+超声组的bcl2蛋白阳性表达率显着降低(P<0.05),而空白对照组和顺铂组的细胞内bcl2蛋白阳性表达率差异无显着性(P>0.05)。bax蛋白阳性表达率在各组表达差异无统计学意义(P>0.05)(见表4、图2)。表4 顺铂和血卟啉联合作用下COC1/DDP细胞的bcl2蛋白及bax表达阳性率

　　3 讨论

　　声动力疗法（SDT）是指对肿瘤患者静脉注射声敏剂,而后用必定频率和强度超声辐射肿瘤部位,使凑集在肿瘤部位声敏剂发生抗肿瘤因子而杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤的生长。有学者以为由于超声产生空化作用,其成果是起源于声敏剂的自由基,再与氧分子反响天生过氧基和烷氧基,过氧基和烷氧基与溶液中的有机分子反映活性低,更易于达到靶细胞的表面,损坏癌细胞的脂质和细胞膜,导致膜通透性加强而损伤细胞,此外,过氧基和烷氧基还可以导致癌细胞内蛋白质变性,染色体变异等损坏细胞。目前认为较好的声敏剂还是卟啉类为主［4］,因此本实验选择血卟啉做声敏剂能对超声有良好的敏感性,发生大批活性氧对细胞进行杀伤作用。

　　本实验发明,COC1／DDP细胞对顺铂显着耐药,血清峰值浓度(2.5 g／ml)以下的顺铂对COC1／DDP细胞增殖未见明显影响,这与文献报道基础一致［5］。但与血卟啉合用时,血清峰值浓度以下的顺铂明显抑制了COC1／DDP细胞增殖。提示超声激活的血卟啉能够提高耐药的卵巢癌细胞COC1／DDP对顺铂的敏感性,从而增长顺铂对该细胞的杀伤作用。干扰细胞周期并诱导凋亡是顺铂治疗肿瘤的主要门路,而血清峰值浓度的顺铂对COC1／DDP的凋亡率几乎无影响,但与血卟啉合用时,可致细胞凋亡率显着升高，这提醒超声激活的血卟啉进步耐药细胞株COC1／DDP对顺铂敏感性的机制可能是恢复了耐药细胞株的凋亡道路,从而恢复了顺铂治疗肿瘤的作用。

　　细胞凋亡是在基因把持下的细胞自身灭亡进程,涉及一系列的基因表达的级联反映,受凋亡克制基因（bc12/bax）和凋亡增进基因的调控。顺铂可以引诱细胞凋亡,但耐药卵巢癌细胞中bc12/bax显明增高,这是导致细胞耐药的主要原因之一。因此,抗肿瘤治疗中,有效地下降bc12/bax含量是取得疗效的要害之一。

　　已有研讨发明,进步细胞内活性氧的水平,细胞凋亡的产生率显明增添,以为细胞内的ROS作为一种信使分子在调控细胞生存及凋亡进程中起要害作用［6,7］。1988年,Vaux等［8］ 首先证实bcl2基因高表达可显着延伸细胞的生存周期。体外研讨亦表明bcl2可禁止很多刺激物诱发的细胞凋亡,且bcl2的克制可能是细胞凋亡的共同通道［9］。 bax是bcl2家族的另一成员,与bcI2形成异二聚体,也对细胞凋亡进行调控［10］。在体内,bcl2与bax相互影响,相互拮抗,其作用并不直接表示为单独的bcl2和bax对凋亡的影响,而是由bcl2／bax来决议细胞是否发生凋亡。研究显示，bc12／bax比值下降,可使肿瘤细胞发生凋亡,作为细胞调亡调控的重要因子bcl2蛋白家族,尤其是bcl2和bax的相互作用在调亡的调节中起症结作用。本试验的 bcl2蛋白及bax蛋白免疫细化染色成果显示，超声激活的血卟啉结合顺铂作用人卵巢癌细胞株COC1/DDP，bcl2蛋白程度明显低于对比组(P<0.05);而顺铂组和对照组比拟,bcl2蛋白阳性表达率差别无统计学意义。阐明超声激活的血卟啉结合顺铂作用可以下降人卵巢癌细胞株COC1/DDP的bcl2蛋白的表达程度,bax蛋白表达水平在实验组及对照组差别均无统计学意义,提醒声动力作用是通过下凋bcl2蛋白的水平,使bcl2／bax的比值降落来增进人卵巢癌细胞株COC1/DDP产生凋亡。

　　声动力疗法（SDT）是继手术、放疗、化疗后新兴的一种肿瘤治疗手腕,具有无创、细胞毒性低、选择性杀伤等长处。本实验仅初步研究了超声激活的血卟啉联合顺铂对耐药的卵巢癌细胞的作用,还须要进一步增添超声的剂量,将血卟啉的浓度范畴扩展,找出三者协同作用的Zui佳比例,为以后利用于临床供给理论基本。

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