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　　 【摘要】目标 应用低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞定向分化。方式 分别人骨髓，利用梯度离心法进行MSCs的培育，取第三代细胞应用低强度间断负压诱导分化;颠倒显微镜下视察细胞的形态，检测碱性磷酸酶(ALP)活性，茜素红染色察看钙结节形成，免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和骨掩护素的表达。成果 低强度间断负压引诱2周后，细胞浮现出成骨细胞形态，ALP活性显明加强，茜素红染色可见钙结节形成，Ⅰ型胶原和骨维护素表达阳性。结论 利用低强度间断负压可以胜利的诱导MSCs向成骨细胞定向分化，诱导的细胞具有典范的成骨细胞特征。

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　　【要害词】 负压 骨髓间充质干细胞 成骨细胞 诱导

　　Low-intensity interrupted negative pressure induces human marrow mesenchymal stem cells differentiating into osteoblasts

　　Yang Zhi, Liu Miao, Zhang Yingang, Guo Xiong, Xu Peng

　　(1. Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Key Laboratory of Environment and Genes Related to

　　Diseases of Ministry of Education, Institute of Environmental and Endemic Diseases,Xian Jiaotong University, Xian 710061; 3. School of Materials Science and Engineering,Xian Jiaotong University, Xian 710049, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effect of low-intensity interrupted negative pressure on the differentiation of human marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into osteoblast in vitro. Methods MSCs were isolated from adult marrow using density gradient separation method, passage 3 cells were chosen to induce differentiation; the differentiation of MSCs was examined by phase-contrast microscopy, the determination of alkaline phosphatase (ALP) activities, alizarin-red staining and the immunohistochemistry of typeⅠcollagen and osteoprotegerin. Results MSCs showed a typical appearance of osteoblasts after 2 weeks induction by low-intensity interrupted negative pressure, the activities of ALP were increased significantly, calcium nodes were seen by alizarin-red staining, the expressions of collagen typeⅠ and osteoprotegerin were positive. Conclusion Low-intensity interrupted negative pressure could successfully induce human MSCs into osteoblasts and the induced cells show characteristics of osteoblasts.

　　KEY WORDS: negative pressure; marrow mesenchymal stem cell; osteoblast; induction

　　近年来，负压封闭引流技巧(vacaum assisted closure, VAC)在外科创面处置方面取得了宏大的胜利，该项技巧能改良创面血供增进创面愈合测量显微镜。负压技巧对骨组织有何作用以及作用的机制如何，能否用来增进骨折愈合、治疗骨坏逝世等方面，国内外尚无学者对其进行研讨。本研讨在预试验的基本上通过察看低强度间断负压对人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)引诱分化的影响，以论述其作用机制，为今后在骨折愈合和骨坏逝世方面的研讨供给理论根据。

　　1 资料与方式

　　1.1 资料

　　骨髓2例取自我科诊断为髋关节骨性关节炎，行人工关节置换的手术患者，年纪分辨为56岁和61岁。两例患者肝肾功效正常，无代谢性骨病及沾染病，手术前经患者批准，术中截骨后经骨髓腔抽取骨髓5mL，吸进预先加有肝素的针筒备用。

　　1.2 主要试剂与仪器

　　L-DMEM培养基、胰蛋白酶均为Gibco产品，Percoll分离液为Sigma产品(1.073 g/mL)，胎牛血清(杭州四季青)，Ⅰ型胶原和骨保护素免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，完整培养基的组成：L-DMEM培养基参加100 mL/L胎牛血清，测量显微镜，青、链霉素终浓度为100 u/mL，微型负压仪。

　　1.3 细胞原代培养

　　细胞采取梯度离心法进行培养：将抽取的骨髓分装入离心管，参加 L-DMEM培养基2 mL，1 500 r/min离心5 min往除上层脂肪滴和上清，以D-Hanks液重悬细胞后平展于Percoll分别液上，1 500 r/min离心10 min，汲取中间层的白膜层(单核细胞层)，以D-Hanks液洗涤，加进L-DMEM培养基置入无菌培养瓶中，37 ℃、5%(体积分数)的CO2孵育箱培养。

　　1.4 负压诱导

　　取第三代细胞进行负压诱导，把24孔和6孔造就板中培养液预先吸掉4/5，打开盖置进自行设计的无菌密闭容器中，容器侧面有孔和导管与微型负压仪相连，打开负压仪设置压力为20 kPa，30 min/次，2次/d。每次诱导完毕后取出培养板补足培养液，实验分为负压诱导组和正常培养组。

　　1.5 细胞视察

　　颠倒显微镜下逐日察看细胞的生长情形和形态特色，拍照记载。

　　1.6 碱性磷酸酶活性的测定

　　引诱2周后，两组细胞用考马斯亮兰微板法测定每孔中细胞蛋白含量，采取碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)试剂盒测定细胞ALP活性，定量测定两组细胞中均匀每毫克蛋白质的ALP活性变更，比拟两组的差别。

　　1.7 茜素红染色

　　诱导2周后，倒掉培养液，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲刷3遍，茜素红染色8 h，显微镜下视察阳性成果。

　　1.8 免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和骨维护素的表达

　　诱导2周后，细胞用40 g/L多聚甲醛固定20 min，进行Ⅰ型胶原和骨掩护素免疫组织化学检测，一抗为鼠抗人Ⅰ型胶原和骨维护素单克隆抗体，DAB显色。

　　1.9 统计学处置

　　利用SPSS11.0统计软件进行数据剖析，成果用均数±尺度差( ±s)表现，以t检验进行数据剖析，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 颠倒相差显微镜所见的细胞形态的变更

　　用间断负压诱导的细胞增殖速度略低于正常培养组细胞，细胞形态逐渐由梭型向多角型转化，带有数个崛起，数目和形态不定，10-14 d细胞融会成单层，2周后逐渐形成多个散在的致密岛状构造，而正常培养组细胞的形态大部分为梭型。诱导成功后，细胞1周左右传1代，可稳固传10代。

　　2.2 ALP活性的测定

　　诱导2周后，间断负压诱导组的细胞ALP活性为(15.68±1.97)u/g，正常培养组为(6.34±1.21)u/g，t检验两组差别有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3 茜素红染色和Ⅰ型胶原及骨保护素的免疫组织化学检测

　　负压诱导2周后，茜素红染色可见多个散在散布大小形态各异的不透明棕红色钙化结节(图1A)。Ⅰ型胶原免疫组织化学染色负压组细胞胞浆中呈现大批黄褐色颗粒，阳性反映(图1B)，正常培养组阴性反响;骨保护素免疫组织化学染色显示表达程度明显进步(图1C)。

　　3讨论

　　MSCs是骨髓中除造血干细胞以外的另一种干细胞，其起源稳固、分别培养相对简略及具有多向分化的才能，因而成为近年来研究的热门。同源MSCs不产生免疫排挤反映，取材便利，是组织工程骨种子细胞的良好选择。由于MSCs是骨修复进程中成骨祖细胞的重要起源，作者为了揭示负压诱导对骨折、骨不连及骨坏逝世有何作用，首先从细胞角度研究负压诱导对人MSCs分化的影响。本试验立足于国内外学者对于负压封闭引流技术的实验研究及临床利用的基本之上，实验进程中将含少量培育液的MSCs培养板放在无菌密闭负压容器之中时，容器内的负压使细胞表面受到牵张应力的同时，也导致细胞缺氧。作者斟酌高强度负压条件下会导致MSCs细胞凋亡急剧增添，所以采取低强度间断负压进行诱导造就。

　　作者以为负压诱导对MSCs分化的影响重要是通过机械刺激和细胞缺氧两种机制共同作用的结果，激活细胞内信号传递通道。实验过程中细胞表面受到牵张应力的机械刺激。机械刺激是细胞在生物进化过程中受到的Zui基础刺激之一，恰当的力学刺激可促进其生长分化。生物机械刺激是影响骨组织形成和分化的重要外源性因素，力学信号传递至细胞内从而启动和调节相干基因蛋白的表达散布支架。Aaron等相差显微镜对MSCs间断施加机械刺激表明可以促进细胞外基质的合成和骨成熟，Wiesmann等支架利用牵张应力作用于MSCs 3周发明Ⅰ型胶原和骨衔接素表达加强，细胞有显明矿化结节形成，Simmons等测量显微镜应用牵张应力与成骨性诱导剂复合干涉MSCs，发现细胞外基质矿化是对比组的2.3倍。细胞的基质矿化和成骨性分化是通过ERK1/2信号介导。我们发现低强度间断负压可以使MSCsⅠ型胶原表达加强，进而增进了细胞的成骨分化;负压诱导过程中，细胞在受到牵张应力作用的同时还合并缺氧。Lennon等支架研究发明，低氧条件下培养大鼠MSCs能增长其骨形成才能。HIF-1是调节氧稳态的核心转录因子，在机体的生理和病理过程中起要害性作用。低氧引起骨系细胞的功效变更主要通过HIF-1α来介导。HIF-1α及其下游基因VEGF表达增添，从而改良骨组织血供代偿低氧状况测量显微镜。Towler等支架以为在骨组织发育和塑型改建过程中HIF-1α具有促进成骨细胞发育和分化的作用，晋升HIF-1α介导可以加速细胞的成骨作用促进骨折修复。负压诱导中HIF-1α和Ⅰ型胶原两者之间应当有协同关系。Ⅰ型胶原的表达一方面与应力刺激有关，另一方面可能通过HIF-1α来介导，这有待进一步的研究。实验检测指标ALP是细胞向成骨细胞分化的主要标记酶，是成骨细胞早期和中期分化的主要标记，也是评价机体成骨活性和组织分化才能的特异性指标。ALP的活性高下与成骨细胞分化呈正相干关系。本实验结果显示经间断负压诱导后MSCs的ALP活性比正常培养组明显进步，具有统计学意义;成骨细胞在钙化条件下培养具有体外矿化这一特色，也是成骨细胞的一种标记。本实验通过茜素红染色，发明负压诱导2周后可见多个散在散布大小形态各异的不透明棕红色钙化结节。杨林等[9]发现人MSCs向成骨细胞分化过程中骨保护素的表达逐渐进步。本研究结果显示间断负压诱导可以促进MSCs对骨保护素的高表达，与其结论一致。综上所述，本实验通过间断负压诱导后的细胞为成骨细胞，进一步证实分离培养的细胞为成骨细胞的前体细胞MSCs。但是，本实验方式中机械刺激的生物信号和HIF-1α调控两者结合作用的分子生物学机制尚须进一步的研究。

　　我们通过间断负压胜利的诱导体外培育的人MSCs向成骨细胞分化，细胞可以稳固传代。一方面阐明人MSCs经体外间断负压造就扩增后可以得到相当数目的成骨细胞，种植于具有良好生物相容性和可塑性的细胞构造上，将为组织工程学修复骨或软骨缺损供给更辽阔的起源;另一方面为我们进行负压诱导对骨折、骨不连及骨坏死影响的试验研究打下了良好的基本，为其尽早的服务于骨科临床供给根据。

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　　构造Wiesmann A, Buhring HJ, Mentrup C, et al. Decreased CD90 expression in human mesenchymal stem cells by applying mechanical stimulation [J]. Head Face Med, 2006, 2:8.

　　支架Simmons CA, Matlis S, Thornton AJ, et al. Cyclic strain enhances matrix mineralization by adult human mesenchymal stem cells via the extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) signaling pathway [J]. J Biomech, 2003, 36(8):1087-1096.

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　　测量显微镜Wang Y, Wan C, Deng L, et al. The hypoxia-inducible factor alpha pathway couples angiogenesis to osteogenesis during skeletal development [J]. J Clin Invest, 2007, 117(6):1616-1626.

　　支架Towler DA. Vascular biology and bone formation:hints from HIF [J]. J Clin Invest, 2007, 117(6):1477-1480.

　　[9]杨林，海涌，曲铁兵，等. 骨保护素和骨掩护素配体在人骨髓基质细胞向成骨细胞分化进程中的表达 [J]. 中国骨质疏松杂志, 2007, 13(5):339-341.


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