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动物细胞培养实验

https://www.optical17.com 来源:原创 日期:2010-12-30 11:04:09
   动物细胞培育试验

   细胞培养是用无菌操作的方式将动物体内的组织(或器官)取出,模仿动物体内的生理条件,在体外进行培养.使其不断地生长、滋生,人们借以观察细胞的生长、滋生、细胞分化以及细胞朽迈等进程的性命现象。

  细胞培养的突出长处,一是便于研讨各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响;二是细胞培养便于人们对细胞内构造(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等进程的观察。因而细胞培养是摸索和唆使细胞性命运动规律的—种简便易行的实验技巧,同时我们也不可疏忽的另一个因素,那就是它脱离乐生物机体后的—些变更。

  细胞培养技巧目前已普遍地被利用于生物学的各个范畴。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等

  为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识,懂得动物细胞培养的根本操作过程,观察体外培养细胞的生长特征,对原代细胞与传代细胞有一个基础概念。

  本实验分两次进行.即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。

  Ⅰ清洗与灭菌

  一、试验目标

  能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒,控制干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作,懂得化学消毒法的使用方式。

  二、实验原理

  清洗与消毒是组织培养实验的第一步,是组织培养中工作量Zui大,也是Zui基础的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对干净和无菌的请求水平很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿,不仅要求清洁透明,无油迹,而且不能残留任何物质。如有毒的化学物资,哪怕残留0.1个,也可能影响细胞生长。灭菌手腕的选择十分主要,对不同的物品需采取不同的灭菌方法。假如选用的方法不对,即使到达了无菌却使被灭菌药品损失了营养价值、生物学特征或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都先容其使用范畴。

  三、实验资料、用品

  资料:无臭氧型紫外灯,微孔滤膜(直径25):孔径为0.22μm,微孔滤膜(直径90):孔径为0.22 μm,过滤器(直径25)。

  药品:70%或75%酒精,0.1%新洁尔灭,煤酚皂溶液(来苏儿水),0.5%过氧乙酸,乳酸,37%甲醛,高锰酸钾,NaOH,盐酸,重铬酸钾,浓硫酸(产业),DEPC水[体积分数0.1%的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。

  仪器:超净台,干燥箱,高压锅,过滤器,过滤泵。

  四、实验步骤

  (一)清洗

  1.新玻璃器皿的清洗先用自来水洗擦,再浸泡5%稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物资和其他有害物资。

  2.使用过的玻璃器皿的清洗

  (1)使用过的培养用品应立即浸进净水,避免干枯难洗。

  (2)用洗涤剂清洗玻璃器皿,自来水清洗数遍,颠倒自然干燥。

  (3)浸酸性洗液过夜。

  (4)从酸性洗液捞出后自来水冲刷10.15次往除残余酸液,蒸馏水涮洗3次,颠倒烘干。

  (5)包装(牛皮纸或一般纸)。

  (6)高压(15磅20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。

  (7)贮存备用。

  3.胶塞的处置

  (1)新胶塞应先用净水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸lO-20 min。

  (2)自来水清洗10次。

  (3)再用1%稀盐酸浸泡30 min。

  (4)自来水清洗10次,蒸馏水涮洗3次。晾干,高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。旧胶塞不必用酸碱处置可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次,过蒸馏水,晾干,包装并高压灭菌后,便可应用。

  (二)消毒

  1.物理消毒法

  (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿,如塑料造就皿、培养板等。这是常应用的消毒方式之一。

  (2)干热灭菌 重要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内,加热至160℃,保温90-120 min。用于RNA提取实验的用品则需180℃,保温5-8 h。

  (3)湿热灭菌 此办法也称为高压蒸汽灭菌,是Zui有效的一种灭菌办法。重要利用范畴是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不产生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手动高压灭菌锅操作如下:

  ①首先查看高压锅内的水是否充分,放人物品盖好盖。

  ②加热高压锅。将放气阀打开,放气5—10 min,以消除锅内的冷空气。

  ③待锅内水沸腾后,落下放气阀持续升温升压,玻璃器皿等用15磅(121℃)30 min,胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 ℃)20 min。调节火力大小坚持该压力。

  ④结束加热,待压力自然降落至0再打开放气阀排汽,开盖,取出高压灭菌的物品烘干。

  电热主动灭菌锅使用阐明(型号:SANYO Autoclave MLS-3020):

  ①放气筒加水至LOW程度线处,将与高压锅相连的导气管插进放气筒里,然后将放气筒回于原位。

  ②打开高压锅盖,参加蒸馏水至高压锅底的水位线,水位线位于V型凹槽的1/3-2/3处。

  ③打开电源。

  ④设定高压温度及时光,高压锅的温度规模为105-121℃,高压灭菌一般采取121℃20—30 min。

  ⑤把待高压的物品置于高压锅内,顺时针方向将exhaust钮旋至close地位。

  ⑥封闭高压锅盖,旋至显示屏上左上角的红亮点刚呈现为止。

  ⑦按start钮,开端高压,在温度达80℃时显示器开端显示温度,当温度到达所需的设定温度时,在显示屏的左下角有一长形的唆使灯闪亮,直到高压时光停止后唆使灯灭,此时蜂叫器报警一声。当压力降至0 MPa时,蜂叫器再报警一声。温度降至80℃时,蜂叫器报警10次。显示屏温度指导消散,此时才可打开锅盖。

  ⑧关电源,开高压锅盖,取出已灭菌的物品,烘干。

  (4)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器,配上可以调换的微孔滤膜,极大地便利了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90 mm、100 mm、142 mm……等),配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推进的塑料小滤器(直径20 mm、25 mm等)。滤膜孔径有0.60 μm、0.45 μm、0.35 μm、0.22 μm、0.10μm等,以0.22 μm除菌Zui为保险,但对于较粘稠难滤过的液体,仍需选用孔径较大的滤膜。

  ①在过滤器上装上微孔滤膜,孔径为0.22μm。

  ②用布包好,湿热灭菌后使用。

  2.化学消毒法

  常用的消毒液有如下几种:

  (1)70%(或75%)酒精:超净台里常备70%酒精棉球(卫生级酒精),用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。

  (2)0.1%新洁尔灭:主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的干净。超净台旁应常备盛有0.1%新洁尔灭溶液的容器及纱布。

  (3)来苏儿水(煤酚皂溶液):主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗,以及空气喷撒消毒,特殊是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上阐明。

  (4)0.5%过氧乙酸:是强效消毒剂,10 min即可将芽孢菌杀逝世。用于各种物品的表面消毒,用喷撒和擦拭方法进行。

  (5)乳酸蒸气:将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1—3 d。可将空气中漂浮的微生物杀死。

  (6)37%甲醛加高锰酸钾:使用前先紧闭门窗。将37%甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾,敏捷放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1—3 d后方可到达消毒空气的目标。

  3.煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法,器械等煮沸15 min后使用。 五、注意事项

  1.清洗玻璃制品时,浸酸之后必定要用自来水冲刷10—15次。由于残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷,否则侵害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和Tube必定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的后果。

  2.干热灭菌时,应在白天使用烤箱,并不断观察,以免产生意外。当温度超过100℃时,不能再打开烤箱门。器皿烤完后,待温度降至100℃之下才干开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。.

  3.高压灭菌后器皿务必晾干或烘干,以防包装纸湿润发霉。

  4.牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液,均不能高压(如TdR,秋水仙素,谷氨酰胺,异硫氰酸胍,MOPS等)。

  5.滤过除菌时,滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸),包好,经高压灭菌后才干使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大,压力数字以2为宜。压力太大时微孔滤膜可能决裂,或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时地位要正确。另外滤器包装时,螺钉不要拧得太紧,以防高压蒸汽不能进入,待高压灭菌之后,再拧紧使用。

  6.应用化学消毒法时,配制75%酒精利用卫生级,不要用化学纯、剖析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒,它对皮肤有刺激性。空气消毒时,所有的物品要事先筹备齐全并使消毒者有较便利的退出道路。由于甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和损害作用。

  六、思考题

  1.哪些物品合适于高压灭菌,并阐明理由。

  2.紫外线消毒的实用范畴和目的是什么?

  II、传代细胞培养与观察

  一、实验目标

  懂得传代细胞的传代方法及操作过程,学习观察体外培养细胞的形态及生长状态

  二、实验原理

  传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或1:2以上的比例转移,接种到另一培养瓶的培养。

  这种培养,第一步也是制备细胞悬液,当细胞长成致密单层时,它很轻易被蛋白水解酶和EDTA)所损坏。所以—般采取胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混杂物,做为消化液。

  细胞培养是一种操作繁琐而又请求十分严谨的实验技巧。要使细胞能在体外长期生长,必需满足两个基础请求:一是供应细胞存活所必须的条件,如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、合适的温度,注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严厉把持无菌条件。

  三、试验用品

  1、器材

   解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好,9.9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。

  此外,还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标志笔、解剖板等。

  2、试剂

  L磷酸盐缓冲液(PBs)

  无钙、镁溶液

  细胞消化液:o.5%胰蛋白酶和o.4%EDTA

  EMEM液

  3%谷氨酰胺

  o.5%台盘蓝染液等

  3、资料

  喉癌细胞

  四、实验办法

   在做传代细胞培养之前,首先将培养瓶置于显微镜下,观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层,如已长成单层,即可进行细胞的传代培养。

  1.营养液配制:

  EMEM液 90%

  犊牛血清 10%

  双抗(1万单位/m1) 加至约100单位/m1

  3%谷氛酞胺 1m1

  7.4%NaHCO3 调pH至6.8—7.0

  2.换液:

  在酒精灯旁打开瓶塞,倒往瓶中的细胞养分液。

  3.消化与分装

  在上述瓶中参加1mlEDTA溶液,轻轻动摇,将溶液倒出。反复上述动作。参加适量消化液(0.02%EDTA或0.04%EDTA1ml十o.5%胰蛋白酶液0.2ml)以盖满细胞为宜,置于室温,停留1—2min后,翻转培养瓶,肉眼观察细胞单层是否涌现缝隙(针孔大小的空隙),如涌现缝隙,即可倒往消化液;如末呈现缝隙,则可将瓶翻回,持续进行消化,直到涌现缝隙为让。此时,可倒去消化液,加入新配制的营养液20m1。然后用吸管汲取培养瓶中的营养液,重复奏乐瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全体脱落下来为止。此时,可持续轻轻地奏乐细胞悬液,以使细胞散开。随之进行分装。

  4.造就

  分装好的细胞瓶上,做好标记,注明细胞代号、日期。置于培养架上,轻摇使细胞均匀散布,以免堆积成团。然后置于37℃培养。

  5.观察

  (1)视察体外培养细胞的几个问题;

  细胞培养24h后,即可进行观察,观察的重点如下:

  A.首先要察看培育细胞是否污染。重要视察造就液色彩的变更及混浊度

  B.察看培育姬色彩变更及细胞是否生长。

  C.如细胞已生长,则要观察细胞的形态特点并断定其所处的生长阶段,麦克奥迪。观察时可参照(2)的描写进行。

  D.察看完毕,可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以断定逝世、活细胞的比例。

  (2)细胞的生长阶段及其形态特点

  传代培养的细胞需逐日进行观察,注意细胞有无污染,培养液色彩的变化及细胞生长的情形。—般中层培养的细胞,从培养开端,经过生长、繁殖、朽迈及死亡的全过程。它是一个持续的生长过程,但为了观察及描写,人为地将具分为5个时代,但各期间无显明尽对界线。现分辨描写如下:

  A.游离期:当细胞经消化疏散成单个细胞后,由于细胞原生质的压缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以,此时细胞多为圆形,折光率高,此期可延续数h。

  B.吸附期(贴壁):由于细胞的附壁持性,细胞悬液静置培养一段时光(约7—8h)后,便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞,如圆形、扁形、短菱形。细胞的特色,大多立体感强,细胞内颗粒少,透明。

  C.繁殖期:培养l2h以后直到72h,细胞进进滋生期,加速了细胞生长和决裂。此期包含由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密凑集而出现的孤立细胞群,常散在地散布在瓶壁上),到细胞展满全部瓶壁(即所谓形成细胞单层)的进程。此期细胞形态为多角形(浮现上皮样细胞的特点)。细胞特色:透明,颗粒较少,细胞间界线明白,并可模糊见到细胞核。依据细胞所占瓶壁有效面积的百分率,又可将其生长状态分为四级。以“十”的多少表现如下:

  十:细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的25%以内有新生细胞。一般要视察3—5个视野内的细胞生长状态,然后加以综合剖析断定。

  十十:细胞占瓶壁有效面积的25—75%以内具新生细胞。

  十十十:细胞占瓶壁有效面积的75—95%具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。

  十十十十:细胞占瓶壁95%以上,细胞已长满或接近长满单层,细胞致密,透明度好。

  从十十一十十十十为细胞的对数增加期(或称为指数增加期)。 D.保持期:当细胞形成良好单层后,细胞的生长与决裂都减缓,并逐渐结束生长,这种现象被称为细胞生长的接触克制。此时细胞界线逐渐含混,细胞内颗粒逐渐增多,且透明度下降,立体感较差。由于代谢产物的不断积聚,保持液逐渐变酸。此时养分液已变为橙黄色或黄色。

  E.衰退期:由于溶液中养分的减少和日龄的增加,以及代谢产物的累积等因素,此时细胞间可呈现空隙,细胞中颗粒进一步增多,透明度更低,立体感很差。若将细胞经固定染色处置后,可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。Zui后,细胞皱缩,逐渐逝世亡,从瓶壁上脱落下来。


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