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　　 一、细胞程度上的研究技术

　　(一)光学显微镜技术 光学显微镜技术(1ight microscopy，LM)是一种常用技术，为了观察某种细胞和组织，将其取下后，用必定的药品(单一的或按配方混杂的)固定，使组织中的蛋白质敏捷凝固，以尽可能保留其自然结构，而后经一系列的处置，将其包埋在石蜡、火棉胶中，用切片机将组织切成薄片(一般是5～10um)。若是石蜡包埋，则应先脱掉切片上的蜡，然后染色，在显微镜下观察。Zui常用的染料是苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)(简称H-E)。苏木精是具有阳离子的碱性染料，可以和组织中阴离子基团亲和形成盐，故凡被苏木精染成蓝紫色的结构和物质则称为嗜碱性物质。伊红是具有阴离子的酸性染料，可以和组织中阳离子基团亲和形成盐，故凡被伊红染成红色的结构或物质，则称为嗜酸性物质。对酸性或碱性染料亲和力均不强者，则称为中性物质。

　　此外，还可以把组织直接放于低温下冻结，然后直接切片、染色，制成标本以便镜下观察，该种程序能较好的保留酶的活性，且程序简便、快速，故常用于酶的组织化学研究及病理的快速诊断。

　　血液(或体液等)可直接涂在玻片上(涂片法)进行观察。一些软组织(如疏松结缔组织、神经组织等)可以撕开展在玻片上(展片法)进行观察。坚硬的骨、牙组织，可以磨成薄片(磨片法)进行观察。

　　(二)几种特别显微镜

　　1．相差显微镜(phase contrast microscope) 未染色的标本不能接收光线，一般光学显微镜下察看这种细胞的结构是艰苦的，视察活细胞的微细构造通常要采取相差显微镜，其原理是通过物镜里的相板和聚光镜上增添了环状光阑，把透过标本的可见光的光程差(相位差)变成振幅差，从而进步细胞内各结构之间的对照度，使未染色的活组织和细胞内各种结构变得更清楚。

　　颠倒相差显微镜(inverted phase contrast microscope) 物镜在物台下，透镜向上，而光源在物台上，光向下射。该种镜实用于对培育瓶(皿)内的活细胞进行视察。

　　2．暗视野显微镜(dark-field microscope) 也能对未染色的资料出现显明对照。其原理是利用特别的暗视聚光器，遮往中心光束的照明，从侧面来的光照耀标本，视野暗，而标本中颗粒所发生的衍射光或散射光进入物镜，浮现出亮点，且十分清楚。因此，可用来观察未染色的活细胞和胶体粒子，以及某些细胞器，如线粒体、细胞核等。

　　3．荧光显微镜(fluorescence microscope) 一般是用高压汞灯产生的紫外线为光源，荧光物质受波长较短的紫外线照耀后，可以激发出波长较长的可见光，后者的波长有赖于发射物质的化学性质。有些物质对某种荧光染料有特异亲和力，如DNA能结合吖啶橙，呈黄色或黄绿色荧光，RNA与吖啶橙结合后则产生橘黄或橘红色荧光。结合荧光物质的抗体与抗原结合后，也可以用荧光显微镜观察。

　　(三)一般组织化学技术 用显微镜和化学剖析两者联合的方式在切片上研究组织或细胞内化学成分的技术称为组织化学(histochemistry)或细胞化学。组织化学可以准确检测组织或细胞内某一化学成分的性质和散布(即定性和定位)，也可以借助仪器进行定量。如欲检测细胞和组织内的多糖类，可用过碘酸希夫反响(periodic acid Schiff reaction，PAS反映)，多糖经高碘

　　酸(HIO4)氧化成多醛，多醛的醛基与无色的Schiff试剂(无色品红)结合成为紫红色沉淀物，沉淀物部位则表现多糖存在的部位(图1-1，式1，2)。

　　再如，欲检测细胞或组织内的酸性磷酸酶，在酸性条件下，使底物在细胞或组织中的酸性磷酸酶催化下分解，发生磷酸根，后者再与参加的铅化合物的铅离子联合，再被硫化铵置换成玄色的硫化铅沉淀，玄色沉淀部位即表现酶存在的部位(图1-2)。

　　

　　用组织化学技巧可以检测细胞或组织内的糖类、脂类、蛋白及酶类等。

　　(四)免疫组织化学技术 这是近年来发展起来的一种新技术，它利用抗体和抗原特异结合的原理，来检测细胞或组织的多肽或蛋白质等大分子物质。这种物质即为抗原，用它免疫动物可以制备抗该种物质的抗体(抗血清)，也可以用该物质制备单克隆抗体，将这种抗体用荧光染料、铁蛋白或辣根过氧化物酶等标记，然后用标记的抗体处理组织切片，标记抗体同组织或细胞内相应的抗原特异性结合，因而，在组织切片上出现有标记物或酶解产物的有色沉淀(酶标记的部位)，即抗原(多肽或蛋白质)存在的部位。用上述标记的抗体与相应抗原结合的方法，称为直接法。另一种是间接法：先用某抗原的抗体(第一抗体)作为抗原，免疫另一种动物，制备抗体的抗体，称抗抗体(第二抗体)，然后对第二抗体进行标记。欲测组织或细胞中某种抗原，先以相应的抗体(第一抗体)处理，抗原与抗体特异结合，而后用标记的抗抗体(第二抗体)处理，它特异地同第一抗体结合，Zui后显色，镜检，显色的部位即是抗原存在的部位。

　　目前Zui常用的免疫组织化学(immunohistochemistry)办法，有过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法(peroxidase-anti-peroxidase complex method，PAP法)和抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidase complex method，ABC法)，这两种办法均属间接法。

　　1．PAP法 重要原理是第一抗体同抗原特异结合，第二抗体既能同第一抗体结合，又能同PAP复合物结合。后者是由过氧化物酶和抗过氧化物酶抗体所组成，Zui后显色反映。该法较直接法和一般间接法敏锐。

　　 2．ABC法 这是近年来发展起来的方法，其重要原理是第一抗体同抗原特异结合，已结合生物素(biotin)的第二抗体再同第一抗体结合。由于一个分子的抗生物素蛋白(avidin)可以同4个生物素结合，Zui后用结合生物素的过氧化物酶和抗生物素蛋白复合物处置，使复合物同第二抗体(已结合生物素)结合，显色后，凡显色的部位即表明抗原存在的部位。该方法比PAP法敏锐20?40倍(图1-3)。

　　(五)细胞造就和组织培育 将人体或动物体的细胞或组织在无菌的条件下于合适的温度、pH、充分的养分进行体外培养称细胞造就和组织造就(cell culture and tissue culture)。这样，细胞或组织可以存活。假如将细胞进行克隆(clone)(从一个细胞决裂而来)纯化，而且能稳固的传代及存活下往，这种细胞群体称为细胞系(cell line)。由于细胞系是由一个亲本细胞决裂增殖而来，故细胞系的每一个细胞同亲本细胞的生物特征雷同。目前国内外树立了很多种动物和人类的正常细胞和肿瘤细胞系，如Hela细胞系(人宫颈腺癌细胞)、Eca-109细胞系(人食管癌细胞系)、BEL-7402细胞系(人肝癌细胞)等，这给试验研究供给了有用的资料。如用肝细胞系来研讨肝细胞的代谢，可避免用整体肝研究肝细胞时肝内其他细胞对肝细胞功效的影响，使所得成果单一可靠。该种技巧是研究性命科学的一种主要手腕，普遍利用于细胞生物学、生物化学、免疫学和肿瘤学等研究。近些年来，人们应用细胞培育、细胞杂交(两种不同细胞的融会)方式，做出了不少成就，增进了性命科学的发展。

　　二、亚细胞程度上的研究技术

　　(一)透射电子显微镜技术 电子显微镜与光学显微镜不同，它是以电子束取代光源，以磁场取代透镜，进行聚焦和放大，Zui后将物体的影象投射到荧光屏或照相底片上。依据辨别率公式：R＝K×λ／NA(K＝常数0．61，λ：波长，NA：镜口率)，电子束波长甚短，故电镜可极大的进步辨别率和放大率，目前电镜的分辩率可达0.2-0.3nm，可放大几十万倍。

　　由于电子易被物体散射和接收，所以组织切片必需非常薄，一般约10～20nm。欲检测的组织需先经药品固定，树脂包埋，重金属盐处理，然后在超薄切片机上用玻璃刀或钻石刀切成超薄切片。用透射电子显微镜(transmission electron microscopy，TEM)观察标本时，电子经过被重金属盐所染的部位，电子被散射的多，则荧光屏上显得暗，图象较黑，称电子致密，反之，则称为电子透明(图1-4)。

　　

　　电压在500kV以上的电子显微镜，称超高压电子显微镜，其电子束可透过较厚的超薄切片。

　　(二)扫描电子显微镜技巧 扫描电子显微镜技术(scanning electron microscopy，SEM)可以用来视察细胞或组织表面，断面和铸型的构造，在显示表面形态时，先将其固定，后在其表面喷镀金或碳，用扫描电子显微镜察看(图1?4)。

　　 (三)冷冻蚀刻 冷冻蚀刻(freeze etch)又称冷冻蚀刻复型(freezeetch replica)。该方法扼要进程如下：①固定和冷冻掩护：取材固定后，转移到甘油中，甘油浸入组织，可维护组织避免冷冻时呈现人工假象。②冷冻：将组织切成小块，浸入液氮冻结。③劈裂：高真空下将组织劈裂。④蚀刻：使温度略微上升，使劈裂表面冰晶升华，从而涌现自然的凸凹现象。⑤复型：以必定角度向表面喷镀一层薄的铂膜，以垂直方向喷一层碳，加固铂膜。⑥清算复型及电镜观察；消化组织取下复型，用透射电子显微镜观察。固然观察的标本并非组织本身，而是劈裂面的铂复型。用此方法可以观察细胞膜内部两层脂质分子间的结构(图1-5)。

　　三、分子程度上几种重要研讨技术

　　(一)放射性核素和放射自显影 用放射性核素作示踪原子，电子显微镜，标志某种氨基酸或其他化合物，可以追踪一些物质在细胞内的合成和其代谢道路，如14C标志的氨基酸可以追索蛋白质的合成，3H-胸苷掺进构成细胞核的DNA，可以研讨其细胞周期等。将摄进放射性物质的细胞或组织，做成切片，或将其某一成分分别电泳，应用射线对感光乳胶的作用，曝光后，经显影、定影后，有放射性核素标记的物资处，浮现玄色银粒，可用肉眼、光镜或电镜进行察看。

　　(二)分子原位杂交 依据核酸分子上碱基互补原则，在DNA和RNA互补链之间进行特异性杂交，此称为分子原位杂交(in situ hybridization)。借此，可以对组织切片和玻片上的培养细胞的核酸片断进行检测和定位。杂交有两种类型：即对细胞核内的DNA杂交和对胞质内的RNA杂交。用已知核酸片断［如互补DNA(cDNA)]作为探针，将其标志上放射性核素、荧光素或联合过氧化物酶的生物素，在原位上对细胞和组织内特异的mRNA和rRNA以及DNA(预先在pH8条件下处置标本，使DNA双链裂开)进行杂交，放射自显影或直接用荧光显微镜观察或酶解底物，浮现色彩反映。该办法定位准确，简便快速，故普遍运用于细胞生物学、组织学和胚胎学。该方法除断定细胞内特异的mRNA种类外，还有以下用处：①测定浓缩染色体上DNA序列的定位。②测定细胞间期细胞核内常染色质上功效结构特点。③一条染色体上某一区段的核酸序列的肯定。④测定微量病毒颗粒。⑤对糖蛋白和多肽激素合成的细胞内定位等(图1-6)。

　　 四、定量分析术

　　在组织、细胞内结构和化学成分定性研究的基本上，对其定量研究是性命科学发展中所必须的，故定量分析技术的运用日趋广泛。

　　(一)显微分光光度定量术 依据细胞或组织内某种物质含量不同，染色深浅不一，对必定波长的光接收不同，应用显微分光光度计(microspeetrophotometer)对该物资进行定量测定。由于消光度与物资的厚度和浓度成正比，将消光度经过一系列的光电组合体系转换为电信号，将其放大，测出光密度值进行定量剖析。对利用组织化学、免疫组织化学、放射自显影和原位杂交术制造的标本，均可运用其进行定量剖析。

　　(二)形态计量术 是利用几何学、统计学原理，肽观察细胞或组织中获得的二维平面，推导出三维立体定量的方法。这种研究物体内某种结构韵立体数值之科学称为体视学(stereology)。通常利用图象分析仪(image analyzer)将观察标本通过摄象机显示于监示器屏幕上，并根据不同结构的色彩深浅(灰度)及各象点的大小、地位，测定出其体积、表面积、周长、均匀厚度、数目、散布等参数，使形态学的研究更有可比价值。

　　(三)流式细胞术 将受检细胞制成悬液，再用荧光染色，然后使这种单细胞悬液快速通过流式细胞计(flow cytometry)的激光照耀小区，将每个细胞发生的荧光信号变成电信号，输进盘算机内，即可测得该组细胞中不同细胞的数目、荧光强度、细胞体积及细胞内构造的含量等参数。由于该方式速度快、准确度高，已普遍利用于细胞周期、DNA、RNA、抗体、受体等方面之分析。

　　胚胎移植，核移植


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