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　　流式检测凋亡的讨论

　　Update:2009-02-22From:ibioo.Com Hot:3684

　　　　关于凋亡的流式检测

　　一、PI单染色法

　　基础原理

　　其原理重要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子程度上所发生的特点性改变。这些改变包含细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变Zui具特点性，主要包含以下几个方面：

　　1.细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研讨表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。很多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标记之一。

　　2.光散射特性：凋亡细胞形态上的转变影响它们的光散射特征。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反应的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光下降，这一特性往往被以为是凋亡细胞的特色之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核决裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增添。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可依据前散射光和侧散射光差别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，依据前散射光和侧散射光断定凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞Zui重要的长处是可以将光散射特征与细胞的表面免疫荧光剖析结合起来，用以差别经这些特别处置产生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。

　　试剂与仪器

　　PBS溶液（配制方式见附录）；

　　PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保留。

　　70%乙醇

　　400目筛网

　　流式细胞仪

　　实验步骤

　　1.收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃往培育液。

　　2.3ml　PBS洗涤1次。

　　3.离心去PBS，加进冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。

　　4.离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。

　　5.400目标筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃往PBS。

　　6.用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。

　　7.流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，发生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

　　8.成果断定：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光下降，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在剖析PI荧光的直方图时，先用门技巧消除成双或凑集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前呈现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在地位的荧光强度为1.0，则一个典范的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照尺度，两者分辨为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完全的细胞。

　　注意事项

　　细胞凋亡时，其DNA可染性降低被以为是凋亡细胞的标记之一，但这种DNA可染性下降也可能是由于DNA含量的降低，或者是因为DNA构造的转变使其与染料结合的才能产生改变所致。在分析结果时应当注意。

　　二、Heochst 33342/PI双染色法

　　基础原理经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性降落。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定进程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞回为活细胞。活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有显明性改变，但细胞膜的通透性已有加强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的构造发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功效受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积聚增添等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更轻易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情形下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表示分辨为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。

　　试剂与仪器

　　lHeochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保留；

　　PI染液 ：用PBS配成5ug/ml浓度，4℃避光保存。

　　400目标筛网

　　流式细胞仪

　　试验步骤

　　1.悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ，终浓度为1ug/ml； 37℃孵育7—10min。

　　2.低温500 ~ 1000r/min离心5min弃去染液。

　　3.参加1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。

　　4.400目标筛网过滤1次。

　　5.流式细胞仪分析：Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400 ~ 500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。

　　6.结果判定：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。

　　注意事项

　　1.在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。

　　2.用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般把持在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判定。

　　三、Annexin V/PI双染色法

　　基础原理

　　细胞凋亡早期转变发生在细胞膜表面，目前早期辨认仍有艰苦。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常重要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂散布的不对称性被损坏而使PS裸露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依附的磷脂结合蛋白，Zui初发明是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特征。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充任一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所奇特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方法间的差异是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就损坏了。因此，可以树立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的唆使并结合一种染料消除实验以检测细胞膜的完全性的检测方法。

　　试剂与仪器

　　孵育缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2

　　标记液：将FITC- Annexin V（宝灵曼公司产品）和PI加进到孵育缓冲液中，终浓度均为1ug/ml

　　流式细胞仪

　　实验步骤

　　1.细胞收集：悬浮细胞直接受集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL　500~1000r/min离心5min，弃去培养液。

　　2.用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。

　　3.用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。

　　4.500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。

　　5.参加荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。

　　6.流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

　　7.成果断定：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏逝世细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染发生红色荧光，而细胞膜坚持完好的细胞则不会有红色荧光发生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此类似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏逝世细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，浮现（FITC+/PI-）。

　　可能存在一下几种原因:

　　1、首先是细胞方面:

　　(1)细胞状况不好(朽迈)

　　(2)流式细胞仪前细胞处置时间过长,如消化后细胞放置时光长,固定不好.

　　(3)离心过度等

　　2、检测试剂问题:过期等.试剂染色时光过长等.

　　3、流式细胞仪:

　　(1)参数设置不是优化的,可以用正凡人血检测机器.

　　(2)假如是Annexin V/PI双染色法,存在Zui后结果划线不准问题.

　　(3)如果PI单染色法,存在没有找到准确的凋亡峰等.

　　PI染色后，流式细胞仪检测调亡的原理

　　hanglh：PI染色后，用流式细胞仪检测调亡的原理，及该看点哪些参考书籍和文献。

　　大通达：实际上用PI染色基本分不出凋亡还是非凋亡性死亡，只是都按凋亡算了而已，因此用PI染色所得的凋亡率要大于实际凋亡率。

　　zbbnet：细胞固定后用PI染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系。由于凋亡细胞核酸内切酶活化，DNA降解，细胞DNA减少，因而可在G0/G1峰前呈现一个亚二倍体峰，也就是凋亡峰。

　　lard：除左跑gel 之外Zui平就是他了. (PI 一?flow sample 才RMB 0.6, 不?机的?)。其?跑gel+PI 已??明那?西是?引起apoptosis。用antibody/kit 都是另有请求.

　　shaman3：实在，PI分不清晚期凋亡和已经死的细胞，在做有关凋亡的流式检测的时候应用的是磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

　　磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，裸露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依附性磷脂联合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标志了的Annexin-V作为荧光探针，应用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的产生。　　

　　碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完全的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和逝世细胞，PI能够透细致胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配应用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区离开来。

　　lard：PI 是?接了?, 但PI + 跑gel 是?有方法中的方法。去ncbi 找一找, 很多paper 也是用PI + 跑gel ?了.

　　DONGHAIJU：参考军事医学科学出版社出版的细胞凋亡的分子医学，胡野，凌志强，单小云主编

　　肠组织匀浆流式细胞检测凋亡的方式

　　coldant: 请问：肠组织匀浆流式细胞检测凋亡的方法

　　schoman: 组织检测凋亡还是很难的。匀浆后大部分细胞轻易受损坏，利用于流式检测不适合。

　　关于Annexin V-FITC和PI双染流式检测方法

　　fjmusy: 我要应用Annexin V-FITC和PI双染的流式检测，须要送到我们医院的流式试验室往由他们做。可是他们没有做过Annexin V-FITC的，只做过PI单染的。

　　1、不知道这样双染和只有PI 的有什么差异吗？

　　2、在送检时对标本的量请求多少？

　　3、成果如何分析？是否要做二倍体（这是什么？阐明什么？）剖析？

　　zhaoqingshan: 以前我做过一些，大致如下：细胞要活的，不能固定，你可以用宝赛的试剂盒(电话是是82020225，我恰好也盘算做了，身边就放了一张名片)，里面有具体的阐明。有些记不情了，细胞是消化下来后，直接加上两种荧光染料，孵育，离心洗去过剩的染料，然后上机检测，因为是活的细胞，尽量做到随做随测。结果盘算凋亡细胞、死细胞、活细胞的比例或者个数就可以了。它分为四个象限，每个象限代表的不一样

　　conanthird: 下面是两种染色的原理：磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

　　磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，裸露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依附性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，应用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

　　碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透细致胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区离开来。

　　方法

　　1、悬浮细胞的染色：将正常造就和引诱凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加进PI（50ug/ml）5ul，避光反映5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对比。

　　2、贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

　　3、爬片细胞染色：同上，Zui后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行察看。

　　注意事项

　　1、全部操作动作要尽量柔柔，勿用力奏乐细胞。

　　2、操作时注意避光，反映完毕后尽快在一小时内检测。

　　drake015: 晶美代理benderAnnexin V-FITC试剂盒

　　目 录 号： LHK601-100

　　储存温度： 2-8℃

　　规 格： 100 Tests

　　有 效 期： 见外包装盒

　　试剂盒组份

　　1、结合缓冲液 4x (Binding Buffer 4x)：体积：20ml（4倍浓缩液）；

　　稀释后溶液中各组分浓度：10mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl2

　　2、碘化丙锭溶液 （Propidium Iodide）体积： 1.0ml；浓度：20ug/ml

　　3、重组人Annexin V/FITC, (rh Annexin V/FITC)

　　来 源：大肠杆菌（E.coli）

　　分 子 量：35.8 KDa

　　样 品 量：0.5ml，可用于100次实验

　　保存方式：于50mM TRIS, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4 溶液中保留

　　纯 度：SDS-PAGE及反相HPLC表明纯度大于98%

　　生物活性：Annexin V可结合于磷酯酰丝氨酸并表示出抗磷酯酶活性

　　应 用：

　　标志的Annexin V可结合流式细胞仪用于检测细胞外膜上的磷酯酰丝氨酸，操作流程如下：

　　1、用去离子水按1:4稀释结合缓冲液（20ml结合缓冲液+60ml去离子水）；

　　2、PBS充足洗细胞，取总数约为5-12.5×104的细胞待测；

　　3、用250ul结合缓冲液重新悬浮细胞并使其浓度为2-5×105/ml；

　　4、取195ul的细胞悬液参加5ul Annexin V/FITC;

　　、混匀后于室温避光孵育10分钟；

　　6、用190ul的结合缓冲液洗细胞一次；

　　7、用190ul的联合缓冲液重新悬浮细胞；

　　8、加入10ul 20ug/ml的碘化丙锭溶液（终浓度为：1ug/ml）;

　　9、流式细胞仪（FACS）分析.

　　实际利用时和使用单位的具体用法有关，Zui好先去和医院fcm操作者接洽一下，核实细胞数、加染色剂的时光以及其他特别要求。

　　操作者一般都会给出分析结果。具体也可以和操作者接洽，可以具体讯问，这里不罗嗦。

　　我用的就是晶美的产品，就我个人的操作这方面已请教了很多人。仅看产品阐明书上的操作步骤还是不行的，不够细。比如Zui根本的是在冰浴中操作就没有提到。但是现在我的麻烦在于流式细胞仪的操作者不知道双染和PI单染的操作有什么差异，所以不愿意给我作

　　cyc1sbs5: 单染和双染在应用流式细胞仪时的差别在于双染时需调剂两种染料间的补偿,不过着须要必定的经验,你Zui好还是找有经验的人做吧

　　dhplc: the difference between single staining and dual stain in annexin v analysis lies on the precision of the results you obtained and,as mentioned above,you must do a complex compensation in dual staining.but any experienced flow cytometry staff has no problem in doing so.

　　as to your issue,i think it's not you but the flow cytomerty staff to think of this tenichological stuff.if he have not such know-how of setting flow cytometer's compensation and still have interests i'd like to give some start informations.

　　fjmusy: 我请教了优美的技巧职员,确切就如cyc1sbs5说的那样,须要调补偿,也就是图象所在象限的调节吧.

　　killwhale：我筹备将载体转染到细胞后检测细胞的凋亡情形，看了坛子里的先容，方法有很多，我想用流式双染和DNAladder两种方法来测。但是流式检测的细胞数较高，一般细胞转染用x10的4次方的细胞就够了，但流式检测需要的细胞量远大于10的4次方。请问：

　　1、流式检测（Annexin V和PI双染）需要的细胞数Zui低多少？

　　2、载体转染后，应该多久测细胞的凋亡比拟好？

　　iceblue909:流式检测（Annexin V和PI双染）需要的细胞数Zui低大概要1×105，Zui好1×106，一个六孔板差未几就够了。

　　长江: 流式检测（Annexin V和PI双染）的办法：

　　1.收集细胞，至少要1.0×105，PBS或Binding buffer洗涤。

　　2.用Binding buffer重新悬浮细胞，需要的量为1.0×105/100ul。

　　3.加Annexin V和PI，室温避光孵育15分钟，并动摇。

　　4.一小时内检测。

　　至于载体转染后，应当多久测细胞的凋亡，应依据你实验所采取的引诱细胞凋亡的试剂或药物而定。

　　wkai: 请问采取AnnexinV与PI双染色（流式细胞仪）检测凋亡，操作是否艰苦？标本若是组织，如何处置？有特别请求吗？另外，AnnexinV与PI是否需离开购置？有相干试剂盒吗？经费需要多少？

　　biowind: 流式细胞仪能测组织吗？思考中........

　　gogowl：不艰苦，有试剂盒卖。成套试剂盒20次的大概1400元左右，单独买很难搞到Annexin V biding buffer。

　　midas: 组织进行流式细胞似乎没有听说过，但是体内组织进行凋亡检测处所法也很多：如tunnel法，DNA ladder，caspase活性检测等等。

　　wkai: 我在文献上看到有研讨将组织分别为细胞进行流式细胞仪检测，只是没有具体方法，不知是否好做。

　　fjmusy: 我要用流式检测贴壁的甲状腺细胞凋亡情形，使用光镜，和PI、Annexin V双染色流式细胞仪检测。敏锐度？可信度？价钱？操作烦琐吗？总之，对硕士研讨生来说，这种办法好吗？还是有更好的方法？

　　qingshi: Annexin VZui可行,利用Annexin V-FITC/PI双染色法是目前检测凋亡的Zui敏感的方法之一，能检测出早期凋亡细胞，并区分出坏死细胞.

　　美国有名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分辨开发了多种标记的Annexin V产品，简便快速，10分钟就可完成检测。其中带荧光标志的Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）及Annexin V-FITC，敏锐度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基本。由于融会蛋白Annexin V-EGFP，EGFP与PS 的联合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还供给生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反映来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采取磁分选办法筛选凋亡细胞。

　　由于PI法实用于死细胞(固定细胞)的细胞周期检测较好,对于凋亡,只能看出后凋亡,前凋亡无法看出.而Annexin V是直接对活细胞检测,前后凋亡都可检出.

　　handshealing: 实在我感到用PI单染就可以了，老外作流式也是用PI单染的，操作也挺便利的！假如经费有限不妨斟酌！

　　ANNEXINFITC: 不是说Annexin V-FITC是检测凋亡的金尺度吗？我干了一年多了还是零。有哪位做过流式Annexin V-FITC检测凋亡的高手能给指导一下迷津？我底本是要做去甲肾上腺素引诱凋亡的，用Annexin V-FITC来检测，可是不论用到多大批的去甲，心肌细胞看起来还是活蹦乱跳的，Annexin V-FITC也做不出结果。这是国外文献有做不少的，然而我做不出来。

　　我是这么做的：原代培养的心肌细胞（约500000个细胞/孔，12孔板）状况良好后低血清（1％FBS）培养24h,加入去甲肾上腺素，再造就24h，然后按解释书操作在流式细胞仪检测细胞凋亡率。看人家写的很简略，可是把去甲的浓度都加多100倍了，也得不到阳性结果！我不知道到底哪里错了，是Zui后Annexin V-FITC的操作有错？还是去甲用的不对？还是加的方法不对？总不会是它原来就没这作用，人家老外都撒谎吧！？

　　hdhdhd0000: 我没做过，但，问：1、老外是不是用的心肌细胞？2、去甲是否失效？3、做Annexin V-FITC时的操作是否有效？

　　ymzhao: 我没做过Annexin V-FITC染色的凋亡测定， 但是我在用神经细胞造凋亡模型时有这样的领会， 假如杂质细胞比例大， 则很难造出损伤， 而且细胞状况要好， 才行。实在不行， 先用Hoechst染色察看一下是否有凋亡。

　　wangzhang: 我固然没有做过Annexin V-FITC的凋亡检测,但做过其他方法的凋亡检测,感到需要注意的是一样的,所以我以为你可以从以下几点斟酌:

　　1、去甲是否对心肌细胞有用

　　2、做凋亡检测时,细胞应该用5%-10%的FBS,而不是1%的FBS,因为在低浓度的血清下,就算什么药都不加,细胞也长不好,这样阴性对比就做不出来了.

　　3、收集细胞时,应当将培育上清也收集,由于有凋亡的细胞漂起来了.

　　4、去甲Zui好买入口的

　　5、你提到"心肌细胞看起来还是活蹦乱跳的",我不太清楚,因为低血清下,原代培养的细胞48小时也能活蹦乱跳的,有点不可思意,你的细胞没有问题吗?

　　xindu0524: 你的阳性对比如何？这点很要害。

　　ANNEXINFITC: 我现在还是没找到原因，还好厂家没太说什么，叫改别的做了。不过，原代培育的乳鼠心肌细胞是会搏动的，造就的好的话可以很明白的看见搏动一波一波地从细胞一端传向另一端并传到相邻细胞，很好玩。唉，就是做不出试验。

　　echo9450627: 我个人认为凋亡的金尺度的电镜检测的照片！

　　


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