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　　微生物实验集锦

　　显微镜的应用

　　应用自然光源镜检时，Zui好用朝北的光源，不宜3采用直射阳光；利用人工光源时，宜用日光灯的光源。

　　　　镜检时身材要正对实习台，采用端正的姿势，两眼自然张开，左眼观察标本，右眼观察记载及绘图，同时左手调节焦距，使物象清楚并移动标本视野。右手记载、绘图。

　　　　镜检时载物台不可倾斜，由于当在五套载物台倾斜时，液体或油易流出，既破坏了标本，又污染载物台，也影响检讨成果。

　　　　镜检时应将标本按必定方向移动视野，直至全部标本观察完毕，以便不漏检，不反复。

　　　　显微镜的重光为对光，接物镜的转换及光线的调节。观察寄生虫标本时，光线调节甚为主要。由于所观察的标本如虫卵、包囊等，均为自然光状况的物体，有大有小，色泽有深有浅，有的无色透明，而低倍、高倍接物镜转换较多，故须随着镜检时对不同标本和请求，须要随时调节焦距和光线，这样才干使观察的物象清晰。在一般情况下，染色标本光线宜强，无色或未染色标本光线宜弱；低倍镜观察光线宜弱，高倍镜观察光线宜强。

　　　　1． 对光：

　　　　（1）将低倍镜转至镜筒下方与镜筒成一直线。

　　　　（2）拨动反光镜，调节至视野Zui亮无暗影。反光镜有平、凹两面，光源强时用平面，较暗时用凹面，需要强光时，将聚光器提高，光圈放大；需要弱光时，将聚光器下降，或光圈恰当缩小。

　　　　（3）将待察看的标本置载物台上，转动粗调节器使镜筒降落至接物镜接近标本。于转动粗调节器的同时，须俯身在镜旁细心视察接物镜与标本之间的间隔。

　　　　（4）左眼于接目镜观察，同时左手转动粗调节，使镜筒渐渐上升以调节焦距，使视野内的物象看到上时即停，再调微调节器，至标本清楚为止。

　　　　2． 接物镜的使用及光线的调节：

　　　　显微镜一般具有三个接物镜，即低倍、高倍及油镜，固定于接物镜转换盘孔中。观察标本时，先使用低倍接物镜，此时，视野较大，标本较易查出，但放大倍数较小（一般放大100倍），较小的物体不易观察其结构。高倍接物镜放大的倍数较大（一般放大400倍），能观察渺小的物体或结构。

　　　　寄生虫的蠕虫卵，微丝蚴，原虫的滋养体及包囊，昆虫的幼虫，均使用低、高倍镜。组织细胞内的原虫，则使用油镜。使用低、高倍镜观察，如在低倍镜下不能正确鉴定所见的物体或其内部结构时，则转高倍镜观察。使用油镜观察，一般加一滴油后直接将油镜头浸进油滴中进行镜检观察。

　　　　3． 低倍、高倍、油镜头的辨认：

　　　　（1）标明放大倍数10×，40×，100×，或10/0.25，40/0.65，100/1.30。

　　　　（2）低倍镜Zui短，高倍镜较长，油镜Zui长。

　　　　（3）镜头前面的镜孔低倍镜Zui大，高倍镜较大，油镜Zui小。

　　　　（4）油镜头上常刻有玄色环圈，或“油”字。

　　　　4． 低倍镜换高倍镜的使用办法：

　　　　（1）光线对好后，移动推动器寻找须要观察的标本。

　　　　（2）如标本的体积较大，不能明白查见其结构因而不能确认时，则将标本移至视野中央，再旋转高倍接物镜于镜筒下方。

　　　　（3）旋转微调节器至物象清晰为止。

　　　　（4）调节聚光器及光圈，使视野内的物象到达Zui清楚的水平。

　　　　5． 油镜的使用方式：

　　　　（1）原理：使用油镜观察时，需加香柏油，因为油镜需要进入镜头的光线多，但油镜的透气孔Zui小，这样进入的光线就少，物体不易看明白。同时又因自玻片透过的光线，由于介质（玻片－空气－接物镜）密度（玻片：n=1.52，空气：n=1.0）不同而产生了折射散光，因此射入镜头的光线就更少，物体更看不清晰。于是采用一种和玻片折光率相接近的介质如香柏油，加于标本与玻片之间，使光线不通过空气，这样射入镜头的光线就较多，物象就看得明白（图2）。

　　　　（2）油镜的使用：

　　　　a．将光线调至Zui强程度（聚光器进步，光圈全体开放）。

　　　　b．转动粗调节器使镜筒上升，滴香柏油1小滴（不要过多，不要涂开）于接物镜正下方标本上。

　　　　c．转动接物镜转换盘，使油镜头于镜筒下方。

　　　　d．俯身镜旁侧面在肉眼的观察下，转动粗调节器使油镜头徐徐降落浸入香柏油内，轻轻接触玻片为止。

　　　　e．慢慢转动粗调节器，使油镜头渐渐上升至见到标本的物象为止。

　　　　f．转动微调节器，使视野物象到达Zui清晰的程度。

　　　　g．左手渐渐移动推动器，并转动微调节器以观察标本。

　　　　h．标本观察完毕后，转动粗调节器将镜筒升起，取下标本玻片。立即用擦镜纸将镜头上的香柏油擦净。

　　　　6． 注意事项：

　　　　（1）使用显微镜之前，应熟习显微镜的各部名称及使用方法，特殊应控制辨认三种接物镜之特点。

　　　　（2）寄生虫学实习中所观察的标本，大多数为无色和颜色较浅，因此必须注意光线的调节。

　　　　（3）新颖标本观察时，须加盖玻片，以免标本因蒸发而干燥变形或污染侵蚀接物镜，同时可使标本表面匀平，光线得以集中，有利于观察。

　　　　（三） 显微镜的颐养

　　　　图3 加用盖玻片后，标本表面匀平，光线得以集中，便于检讨示意图

　　　　1．显微镜在从木箱中取出或装箱时，右手紧握镜臂，左手稳托镜座，轻轻取出。不要只用一只手提取，以防显微镜坠落，然后轻轻放在实习台上或装入木箱内。

　　　　2．显微镜放到实习台上时，先放镜座的一端，再将镜座全体放稳，切不可使镜座全面同时与台面接触，这样震撼过大，透镜和微调节器的装置易破坏。

　　　　3．显微镜须经常坚持干净，勿使油污和灰尘附着。如透镜部分不洁时，用擦镜纸轻擦，如有油污，先将擦镜纸蘸少许二甲苯拭去。

　　　　4．显微镜不能在阳光下暴晒和使用。

　　　　5．接目镜和接物镜不要随意抽出和卸下必须抽取接目镜时，须将镜筒上口净用布遮盖，避免灰尘落入镜筒内。调换接物镜时，卸下后应颠倒在干净的台面下，并随即装入木箱的置放接物镜的管内。

　　　　6．显微镜用完后，取下标本片，经聚光器降下，再将物镜转成“八”字形，转动粗调节器使镜筒降落，以免接物镜与聚光器相碰。

　　7．显微镜应放在干燥的处所，以防生霉。

　　经常性的保护

　　　　（１）防潮假如室内湿润，光学镜片就轻易生霉、生雾。镜片一旦生霉，很难除去。显微镜内部的镜片由于不便擦拭，湿润对其迫害性更大。机械零件受潮后，轻易生锈。为了防潮，寄存显微镜时，除了选择干燥的房间外，寄存地点也应离墙、离地、阔别湿源。显微镜箱内应放置１～２袋硅胶作干燥剂。并经常对硅胶进行烘烤。在其颜色变粉红后，应及时烘烤，烘烤后再持续使用。

　　　　（２）防尘光学元件表面落入灰尘，不仅影响光线通过，而且经光学体系放大后，会天生很大的污斑，影响观察。灰尘、砂粒落入机械部分，还会增添磨损，引起活动受阻，迫害同样很大。因此，必须经常坚持显微镜的干净。

　　　　（３）防腐化 显微镜不能和具有腐化性的化学试剂放在一起。如硫酸、盐酸、强碱等。

　　（４）防热 防热的目标主要是为了避免热胀冷缩引起镜片的开胶与脱落。

　　革兰氏染色法

　　革兰氏染色法是细菌学中普遍使用的一种辨别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家 Christain Gram创建。

　　　　细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在必定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱往，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G?）。为观察便利，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和尽大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反映；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都浮现负反响。革兰氏阳性菌对青霉素敏感，革兰氏阴性菌对链霉素敏感。可依据革兰氏染色法辨别不同菌种并对症下药。

　　　　革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差异，染色反响不一样。现在一般以为革兰氏阳性菌体内含有特别的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物联合很牢，不易脱色，阴性菌复合物联合水平底，吸附染料差，易脱色，这是染色反映的重要根据。另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在雷同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱往，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格节制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反响；PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫?碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时光，脱色办法也应严厉把持。

　　染色原理

　　　　G?菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保存结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

　　　　Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联疏松，乙醇脱色不能使其构造压缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

　　操作流程

　　　　革兰氏染色法一般包含初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作办法是：

　　　　１）涂片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于清洁的载玻片上涂布均匀，固定。

　　　　２）草酸铵结晶紫染1分钟。

　　　　３）自来水冲刷，去掉浮色。

　　　　４) 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去过剩溶液。

　　　　５）用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。

　　　　６）用蕃红染液复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则浮现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被差别开。

　　大肠菌群的测定

　　大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌范畴的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特征的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完整一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般以为该菌群细菌可包含大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

　　简介

　　　　大肠菌群散布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研讨表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常运动的场合以及有粪便污染的处所，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。

　　　　大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，重要是以该菌群的检出情形来表现食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高下，表明了粪便污染的程度，也反应了对人体健康迫害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，埋伏着食品中毒和风行病的要挟，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

　　　　大肠菌群是评价食品卫生质量的主要指标之一，目前已被国内外普遍利用于食品卫生工作中。

　　检验

　　　　由于大肠菌群指的是具有某些特征的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是依照它的定义进行。

　　　　国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制定的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。

　　　　（一）国度尺度：国家标准采取三步法，即：乳糖发酵试验、分别培养和证实试验。

　　　　乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

　　　　分别培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。

　　　　证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。

　　　　报告：依据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。

　　　　具体操作参见GB4789.3-94 《中华国民共和国国家尺度 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》

　　　　（二）原国家商检局制定的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：

　　　　推测实验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

　　　　证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。

　　　　具体操作参见 SN0169-92 《中华国民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》

　　阐明

　　MPN检索表

　　　　MPN 为Zui大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行持续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反映呈阳性管数的呈现率，用概率论来推算样品中菌数Zui近似的数值。

　　　　MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应下降或增长10倍。注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且成果报告单位也不雷同。

　　初发酵和证实试验

　　　　无论是国度尺度的三步法还是行业标准的两步法，都应用了乳糖发酵管进行了两次发酵实验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。

　　　　初发酵阳性管，不能确定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必须的，显微镜报价。

　　产气量与倒管

　　　　在乳糖发酵实验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以碰到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的吝啬泡。试验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全体充斥气体，少者可以发生比小米粒还小的气泡。假如对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻感动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应斟酌可能有气体发生，而应作进一步试验。

　　挑选菌落

　　　　国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为庞杂和多样，而且与大肠菌群的检出率亲密相干。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率Zui高；红色、粉红色菌落检出率较低。

　　　　另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有亲密关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典范时，很难避免假阴性的涌现。所以挑菌落一定要挑取典范菌落，如无典范菌落则应多挑几个，以免呈现假阴性。

　　抑菌剂

　　　　大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的重要作用是克制其它杂菌，特殊是革兰氏阳性菌的生长。

　　　　国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤应用煌绿和胆盐作为抑菌剂。

　　　　抑菌剂虽可克制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制造用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格依照标准方法进行。

　　细菌总数的测定

　　微生物培养方法

　　常见微生物培养基

　　培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和保持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物资、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。

　　按所用原料不同，可分为两类：利用肉汤、马铃薯汁等自然成分配制的，称为自然培养基；运用化学药品配成并标明成分的，称为合成培养基或综合培养基。化学试剂中的培养基，大多为合成培养基。由于液体培养基不易长期保管，现在均改制成粉末。培养基由于配制的原料不同，应用请求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般造就基必需防潮、避光、阴凉处保留。对一些需严厉灭菌的培养基（如组织培养基），较长时光的贮存，必需放在2~6。C的冰箱内。

　　常见培养基有：

　　1、细菌培养基

　　配方一 牛肉膏琼脂培养基

　　牛肉膏0.3克 ，蛋白胨1.0克，氯化钠 0.5克，琼脂 1.5克，

　　水 100毫升

　　在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，参加琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完整溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调剂pH值到7.2～7.6,分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌30分钟。

　　配方二 马铃薯培养基

　　取新鲜牛心（除去脂肪和血管）250克，用刀细细剁成肉末后，加入500毫升蒸馏水和5克蛋白胨。在烧杯上做好记号，煮沸，转用文火炖2小时。过滤，滤出的肉末干燥处置，滤液pH值调到7.5左右。每支试管内加入10毫升肉汤和少量碎末状的干牛心，灭菌，备用。

　　配方三 根瘤菌培养基

　　葡萄糖 10克 磷酸氢二钾 0.5克

　　碳酸钙 3克 硫酸镁 0.2克

　　酵母粉 0.4克 琼脂 20克

　　水 1000毫升 1%结晶紫溶液 1毫升

　　先把琼脂加水煮沸溶解，然后分辨加入其他组分，搅拌使溶解后，分装，灭菌，备用。

　　2、放线菌培养基

　　配方一 淀粉琼脂培养基（高氏培养基）

　　可溶性淀粉 2克 硝酸钾 0.1克

　　磷酸氢二钾 0.05克 氯化钠 0.05克

　　硫酸镁 0.05克 硫酸亚铁 0.001克

　　琼脂 2克 水 100毫升

　　先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。

　　配方二 面粉琼脂培养基

　　面粉 60克 琼脂 20克

　　水 1000毫升

　　把面粉用水调成糊状，加水到500毫升，放在文火上煮30分钟。另取500毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，弥补水分，调整pH值到7.4，分装，灭菌，备用。

　　3、真菌培养基

　　配方一 萨市（Sabouraud’s）培养基

　　蛋白胨 10克 琼脂 20克

　　麦芽糖 40克 水 1000毫升

　　先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入40克麦芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。

　　本培养菌是培养很多种类真菌所常用的。

　　配方二 马铃薯糖琼脂培养基

　　把马铃薯洗净往皮，取200克切成小块，加水1000毫升，煮沸半小时后，补足水分。在滤液中加入10克琼脂，煮沸溶解后加糖20克（用于培养霉菌的加进蔗糖，用于培养酵母菌的参加葡萄糖），补足水分，分装，灭菌，备用。

　　把这培养基的pH值调到7.2～7.4，配方中的糖，如用葡萄糖还可用来培养放线菌和芽孢杆菌。

　　配方三 黄芽菜汁培养基

　　黄芽菜 100克 琼脂 15克

　　葡萄糖 20克 水 1000毫升

　　洗净黄芽菜，加水煮沸30分钟。用纱布过滤，滤液中加入琼脂，加热溶解后放入糖，搅拌使它溶解，补足水分到1000毫升，分装，灭菌，备用。

　　把这培养基的pH值调到7.2～7.4，可用来培养细菌和放线菌。

　　配方四 豌豆琼脂培育基

　　豌豆 80粒 琼脂 5克

　　水 200毫升

　　取80粒干豌豆加水，煮沸1小时，用纱布过滤后，在滤液中加入琼脂，煮沸到溶解，分装，灭菌，备用。

　　4、食用菌菌种培养基

　　配方一 马铃薯?蔗糖--琼脂培养基

　　20%马铃薯煮汁 1000毫升

　　蔗糖 20克 琼脂 18克

　　把马铃薯洗净去皮后，切成小块。称取马铃薯小块200克，加水1000毫升，煮沸20分钟后，过滤。在滤汁中补足水分到1000毫升，即成20%马铃薯煮汁。在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖，煮沸，使它溶解后，补足水分，分装，灭菌，备用。使用该培养基对pH值要求不严格，可以不测定。

　　配方二 综合马铃薯培养基

　　20%马铃薯煮汁 1000 毫升

　　磷酸二氢钾 3克 硫酸镁 1.5克

　　葡萄糖 20克 维生素 10毫克

　　琼脂 18克

　　先配制20%马铃薯煮汁，方式同上。在煮汁中参加上述各种组分，加热溶解后补足水分，调剂pH值到6。分装，灭菌，备用。 该培养基用于培养和保留灵芝、平菇、香菇等食用菌菌种。

　　5.烟草的培养基

　　在植物组织培养时,通过调节IAA和CTK的比值能影响愈伤组织分化出根或芽.CTK/IAA高时,愈伤组织分化芽

　　CTK/IAA低时,分化根;CTK/IAA比例适中保持愈伤组织不分化

　　愈伤组织诱导培养基制备

　　以MS培养基母液为基本,向干净铝锅中次序加入大批元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,铁盐100×母液20mL ,维生素100×母液20mL,肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL,配制得MS培养基后,再加入0.5mg?L-1的BA8mL,0.5mg?L-1的NAA8mL.然后加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水,加入40g蔗糖后搅拌使其溶化,用0.5mol?L-1的NaOH和0.5 mol?L-1的HCl调整pH值至5.8-6.0.加入14g琼脂,将铝锅置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水定容至终体积2L,持续加热几分钟使之混杂均匀后分装于三角瓶中.

　　烟草叶片愈伤组织引诱

　　取一无菌培养皿,用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中,并用解

　　剖刀将叶片切成2mm2左右的小片,然后将其接种于筹备好的培养基上,每瓶接种

　　5小片,一共接种6瓶.接种后的三角平置于24条件下黑暗培养1周,然后在同

　　样温度下有光照和全黑暗下培养3周直至愈伤组织形成(两种情况各置3瓶).观

　　察愈伤组织诱导结果,统计愈伤组织诱导率.

　　器官分化及植株再生培养

　　将引诱的愈伤组织按类型分辨转入分化培养基上,置于持续光照,温度20-22 C条件下培养3周,统计愈伤组织再生植株情形.

　　愈伤组织诱导的总体情况

　　烟草愈伤组织引诱培养4周后,愈伤组织基础形成,即消除因生长时间不够而

　　未形成愈伤的情况.具体情形见表一中所示,6瓶培养物均有愈伤形成,且都未发

　　生污染,但诱导率几乎各不相同.其中, 在光照条件下培养的3瓶均匀愈伤诱导率为

　　60.0?, 在黑暗条件下培养的3瓶均匀愈伤诱导率为46.7%.由于实验进程中,外植

　　体即烟草叶片取得偏小,接种时可能已有部分外植体的大部分细胞脱水死亡,使整

　　个实验的愈伤组织诱导率偏低,愈伤块偏小.

　　特殊培养基：

　　一 选择性培养基

　　1酵母菌富集培养基

　　葡萄糖5% 尿素0.1% 硫化铵0.1% 磷酸二氢钾0.25% 磷酸氢二钠0.05% 七水合硫酸镁0.1% 七水合硫酸铁0.01% 酵母膏0.05%

　　孟加拉红0.003% pH4.5

　　2 Ashby无氮培养基 富集好养自生固氮菌

　　甘露醇1% 磷酸二氢钾0.02% 七水合硫酸镁0.02% 氯化钠0.02%

　　二水合硫酸钙0.01% 碳酸钙0.5%

　　二 辨别培养基

　　EMB培养基，常用于鉴别E.coli

　　蛋白胨 10g 乳糖5g 蔗糖5g 磷酸氢二钾2g 伊红Y 0.4g 美蓝0.065g

　　蒸馏水1000g pH7.2

　　分别海洋微生物的培养基配方

　　2216E培养基配方（固体培养基）

　　蛋白胨 5克

　　酵母膏 1克

　　磷酸高铁 0.01克

　　琼脂 15-----20克

　　培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（酵母产品有几种分类方法。以人类食用和作动物饲料的不同目的可分成食用酵母和饲料酵母。食用酵母中又分成面包酵母、食品酵母和药用酵母等。

　　面包酵母 又分压榨酵母、活性干酵母和快速活性干酵母。

　　①压榨酵母：采取酿酒酵母生产的含水分70～73％的块状产品。呈淡黄色,具有紧密的构造且易粉碎,有强的发面才能。在4℃可保躲1个月左右，在0℃能保躲2～3个月。产品Zui初是用板框压滤机将离心后的酵母乳压榨脱水得到的，因而被称为压榨酵母，俗称鲜酵母。发面时，其用量为面粉量的1～2％,发面温度为28～30℃,发面时光随酵母用量、发面温度和面团含糖量等因素而异，一般为1～3小时。

　　②活性干酵母:采用酿酒酵母生产的含水分8％左右、颗粒状、具有发面能力的干酵母产品。采用具有耐干燥能力、发酵力稳固的醇母经培养得到鲜酵母，再经挤压成型和干燥而制成。发酵后果与压榨酵母相近。产品用真空或充惰性气体（如氮气或二氧化碳）的铝箔袋或金属罐包装，货架寿命为半年到1年。与压榨酵母相比,它具有保藏期长，不需低温保藏，运输和使用便利等长处。

　　③快速活性干酵母：一种新型的具有快速高效发酵力的渺小颗粒状（直径小于1mm）产品。水分含量为4～6％。它是在活性干酵母的基本上,采用遗传工程技巧获得高度耐干燥的酿酒酵母菌株，经特别的营养配比和严厉的增殖培养条件以及采用流化床干燥装备干燥而得。与活性干酵母相同,采用真空或充惰气体保藏,货架寿命为1年以上。与活性干酵母相比,颗粒较小,发酵力高,使用时不需先水化而可直接与面粉混杂加水制成面团发酵，在短时间内发酵完毕即可焙烤成食品。该产品在本世纪70年代才在市场上呈现，深受花费者的欢迎。

　　食品酵母 不具有发酵力的滋生才能，供人类食用的干酵母粉或颗粒状产品。它可通过回收啤酒厂的酵母泥、或为了人类养分的请求专门培养并干燥而得。美国、日本及欧洲一些国度在普通的食粮制品如面包、蛋糕、饼干和烤饼中掺入 5％左右的食用酵母粉以进步食品的养分价值。酵母自溶物可作为肉类、果酱、汤类、乳酪、面包类食品、蔬菜及调味料的添加剂；在婴儿食品、健康食品中作为食品营养强化剂。由酵母自溶浸出物制得的5′-核苷酸与味精配合可作为强化食品风味的添加剂（见核苷酸类调味料）。从酵母中提取的浓缩转化酶用作方蛋夹心巧克力的液化剂。从以乳清为原料生产的酵母中提取的乳糖酶，可用于牛奶加工以增添甜度，防止乳清浓缩液中乳糖的结晶，适应不耐乳糖症的花费者的须要。

　　药用酵母 制作方式和性质与食品酵母雷同。由于它含有丰盛的蛋白质、维生素和酶等生理活性物资，医药上将其制成酵母片如食母生片，用于治疗因不公道的饮食引起的消化不良症。体质虚弱的人服用后能起到一定水平的调剂新陈代谢性能的作用。在酵母培养进程中，如添加一些特别的元素制成含硒、铬等微量元素的酵母，对一些疾病具有必定的疗效。如含硒酵母用于治疗克山病和大骨节病，并有一定防止细胞朽迈的作用；含铬酵母可用于治疗糖尿病等。

　　饲料酵母 通常用假丝酵母或脆壁克鲁维酵母经培养、干燥制成。是不具有发酵力,细胞呈死亡状态的粉末状或颗粒状产品。它含有丰盛的蛋白质(30～40％左右)、b族维生素、氨基酸等物质,普遍用作动物饲料的蛋白质弥补物。它能增进动物的生长发育，缩短饲养期，增长肉量和蛋量，改进肉质和提高瘦肉率，改良皮毛的光泽度，并能加强幼禽畜的抗病才能。包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。

　　酵母菌的形态观察

　　

　　一、试验目标和内容

　　目标：懂得自然存在的酵母菌及其形态构造。懂得酵母菌发生子囊孢子的条件及其形态。

　　内容：

　　1．观察酵母菌个体形态。

　　2．察看酵母菌的假菌丝和滋生进程。

　　3．观察自然状况的酵母菌。

　　二、试验资料和用具

　　酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)斜面菌种。

　　PDA培养基、麦氏(McCLary)培养基(醋酸钠培养基)、0.05%美蓝染色液(以pH6.0的0.02mol/L磷酸缓冲液配制)、碘液、0.04%的中性红染色液%孔雀绿，0.5%沙黄液、95%乙醇；

　　显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、V形玻璃棒、放置一个三角形玻璃棒支架的培养皿。

　　三、操作步骤

　　(一)酵母菌形态观察

　　1．酵母菌的话体染色视察及逝世亡率的测定

　　(1)以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。

　　(2)取0.05%美蓝染色液1滴，置载玻片中心，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。

　　(3)在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5～6个视野。

　　酵母菌死亡率一般用百分数来表现，以下式来盘算：

　　逝世亡率=逝世细胞总数÷死活细胞总数×100%

　　2．酵母菌液泡系的话体观察 于干净载玻片中央加一滴中性红染色液，取少许上述酵母菌悬液与之混杂，染色5min，加盖玻片在显微镜下观察。细胞无色，液泡呈红色。

　　3．酵母菌细胞中肝糖粒的观察 将1滴碘液置于载玻片中心，接人上述酵母菌悬液，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的贮躲物资肝糖颗粒呈深红色。

　　4．酵母菌子囊孢子的观察

　　(1)活化酿酒酵母：将酿酒酵母接种至新颖的麦芽汁培养基上，置28C培养2～3d，然后再移植2～3次。

　　(2)转接产孢培养基：将活化的酿酒酵母转接至醋酸钠培养基上，置30℃恒温培养14d。

　　(3)观察：挑取少许产孢菌苔于载玻片的水滴上，经涂片、热固定后，加数滴孔雀绿，lmin后水洗，加95%乙醇30S，水洗，Zui后用0.5%沙黄液复染30S，水洗去染色液，Zui后用吸水纸吸干。制片干燥后，镜检，子囊孢子呈绿色，子囊为粉红色。注意观察子囊孢子的数目、外形和子囊的形成率。

　　(4)计算子囊形成的百分率：计数时随机取3个视野，分离计数产子囊孢子的子囊数和不产孢子的细胞，然后按下列公式计算：

　　子囊形成率（%）=3个视野中形成子囊的总数

　　÷3个视野中（形成子囊的总数+不产孢子细胞总数）×100%

　　5．酵母菌假菌丝的观察 取一无菌载玻片浸于溶化的PDA培养基中，取出放在温室培养的支架上，待培养基凝固后，进行酵母菌划线接种，然后将无菌盖玻片盖在接菌线上(图12?1)，28℃培养2～3d后，取出载玻片，擦去载玻片下面的培养基，在显微镜下直接观察。可见到芽殖酵母形成的藕节状假菌丝，裂殖酵母则形成竹节状假菌丝(图12?2)。

　　6．自然状况下的酵母菌察看 取一滴美蓝染色液于载玻片中心，春夏秋季取酱油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜汤上的白膜，将其置于载玻片染色液中，盖上盖玻片，显微镜下细心视察酵母菌形态，出芽生殖，假菌丝等。

　　四、注意事项

　　1．用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新颖、表面湿润。

　　2．在产孢培养基上加大移种量，可进步子囊形成率。

　　3．通过微加热增添酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。

　　五、实验报告

　　(一)绘图

　　1．数个酵母菌细胞，示观察到的结构。

　　2．数个子囊及子囊孢子形态图。

　　(二)记载并计数酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始记载及计算结果)。

　　六、问题和思考

　　1．酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何差别?

　　2．如何差别养分细胞和开释出的子囊孢子?

　　3．试设计一个从子囊中分离子囊孢子的试验计划。

　　注：

　　酵母菌的简易培养 配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，装入三角瓶中(液面高度2～2cm )，加HCl调至pH3～5放入几块葡萄皮（或其他糖分较高的果皮），置5～28℃温箱中培养2～3d，闻到酒香味后，即可取培养液镜检

　　微生物检验??倾倒平板法

　　

　　用倾倒平板法作为惯例微生物检验并不很幻想，由于1-2ml的样品量未必能准确显示真正的菌数。即只有当菌数较高（每毫升大于30）时，才干得到正确的成果。然后由于过滤艰苦，对于某些果汁或含果汁饮品还要采取以上方法进行微生物检验作为一般准则，当样品无法过滤时才使用倾倒平板法。

　　二、培养基

　　总菌数 橙血清琼脂

　　酵母和霉菌数 橙血清琼脂（实用于低PH果汁饮料）

　　大肠菌数 EHDV琼脂

　　注：所有造就基必需依据制作商的应用阐明进行配制和杀菌，由于培育基对热敏感，故加热时要避免过热，另外配好的培养基要倒进100-120ml瓶或16-18ml试剂管并盖好，而每个容器里留存15%空间。

　　三、测定方法

　　1. 使用前需将装有培养基的瓶子或试管弄松，然后放在滚水或蒸汽浴里进行溶解，要警惕避免培养基过热变质。

　　2. 溶解之后马上将它们移到47±2℃恒温水槽里，当培养基温度未降到水槽水温之前不能拿出来使用。

　　3. 已消毒培养皿的数目要比所测样品的数目多一个做空缺对比。

　　4. 掀起培养皿上盖，并将样品用无菌吸管或勺子移入培养皿中。

　　5. 采用火焰消毒无菌操作法打开培养基瓶或试管的盖子。并往每个培养皿倒入16-18ml培养基。

　　6. 盖回上盖，并沿着8字行路线稍微移动培育皿使样品与培养皿完整混匀。注意勿将培养皿里的造就基贱到到培养皿壁或盖上。

　　7. 待培养基凝固后，将培养皿颠倒，并于恰当温度进行培养。

　　总菌数 35℃ 大肠菌数 35℃ 酵母和霉菌数 28℃

　　注：①为防止在过滤膜表面形成冷凝水，所有培养皿必须颠倒培养箱中。

　　②在培养箱中放置一烧杯水，以保持恰当温度。

　　8. 橙血清琼脂上酵母和细菌是无法用肉眼分辨的，故除非可借助显微镜。除霉菌之外都当酵母菌计，大肠菌群色彩红色。

　　9. 菌落数的盘算：

　　① 必须分离在培养24h和72h后计算菌群。点计所有菌落（不管类型）并记载Zui高数目。

　　② 酵母?霉菌：在培养48h后计点霉菌和酵母数，并在此后每隔24h再计点一次直到过第三天，记载Zui高数目。

　　A酵母菌通常为圆形白色菌落，有时它们也带颜色，在1～2天后一些酵母菌菌落中心因接收培养剂中唆使剂而成颜色。

　　B霉菌菌落会显示不同色彩（包含白、黄、红、蓝、黑）但以其“绒毛状”或“棉花状”外观很易识别，通常比细菌或酵母菌菌落为大。

　　C细菌菌落通常比酵母菌还快接收唆使剂，而其色彩会变成蓝绿或褐色。在这种培养剂中细菌菌落一般比酵母菌小。

　　D大肠杆菌菌落呈绿色或墨汁色，并有的显金属光泽。在培养24h，另盘算有“金属光泽”的菌落。

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