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　　《激光扫描共聚焦显微镜体系及其在细胞生物学中的利用》

　　摘要激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图象分析仪器，现已普遍运用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通信研究等方面。其性能为广泛光学显微镜质的奔腾，是电子显微镜的一个弥补。本文以美国Meridian公司的ACASULTIMA312为例扼要先容了激光扫描共聚显微镜系统的结构，功效和生物学运用远景。

　　要害词激光；共聚焦显微镜；粘附细胞分析与筛选（ACAS）

　　TheLaserScanningConfocalMicroscopySystemanditsBiologicalApplications

　　ChenYaowen,LinJielong,LaiXiaoying,MeiPinchao

　　(ShantouUni.Med.College,CentralLab,ShantouGuangdong515031)

　　AhstractTheLaserScanningConfocalMicroscopyisanewmedicalimageanalysisinstrument,whichisdevelopedinthelastdecade.Nowitiswidelyappliedinsuchfieldsasfluorescentquantitativemeasurement,conpocalimageandlyusis,3-Dreconstruction,Kineticsignalmonitioringoflivingcell,cellcellcommunicationresearches,etc.Inthispaper,ACSAULTIMA312(MeridianCo,USA)istakenasanexampletointroducetheprincipleofconfocalmicroscopy,itsfunetionsandbiologicalapplications.

　　KeywordsLaserConfocalMicroscopyAdherentCellAnalysisandsorting(ACSA)

　　激光扫描共聚焦显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的Zui主要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基本上加装激光扫描装置，应用紫外光或可见光激发荧光探针，应用盘算机进行图象处置，从而得到细胞或组织内部微细构造的荧光图象，以及在亚细胞程度上察看诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变更。已普遍利用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等范畴[1、2、3]，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研讨具有很大的优胜性，为这些范畴新一代强有力的研究工具。

　　创立于1983年的美国Meridian公司，在90年代推出的“激光扫描共聚焦显微镜”这一项具有划时期的义意的高科技产品，曾获得美国“政府新产品奖”和两次“高科技领先技术奖”，它能到达每秒120幅画面的高速扫描激光共聚焦视察，可供给实时，真彩色的激光共聚焦原色图象。我院Zui近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司Zui新的高科技产品，为同类仪器中档次Zui高、功能Zui全的精密仪器。现以该仪器为例先容激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的运用。

　　1、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成

　　有关共聚焦显微镜的某些技术原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装胜利具有高清楚度的共聚焦显微镜CCD，1985年WijnaendtsVanResandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中利用的文章，到了1987年，才发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。

　　激光扫描共聚焦显微镜成像原理如图1所示，激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物资在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接受。

　　从图1中可以看出，只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够达到检测器，其它地位发出的光均不能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因而称这种方法成像的显微镜为共聚焦显微镜为共聚显微镜。在成像进程中针孔起着要害作用，针孔直径的大小不仅决议是以共聚焦扫描方式成像还是以广泛学显微镜扫描方式成像，而且对图像的对照度和辨别率有主要的影响。

　　ACASULTIMa312采取快速镜扫描或台阶扫描对样品逐点扫描成像，由于样品中不同的扫描点始终在物镜和会聚透镜的光轴上，因而它以雷同的信噪比扫描全部样品，扫描精度达0.1μm，扫描面积Zui大的为10cm×8cm，当激光逐点扫描样品时，针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，并将之转化为数字信号传输至计算机，终极在屏幕上聚合成清楚的全部焦平面的共聚聚焦图像。一个微动步进马达把持栽物台的升降，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标原形应的光学横断面的图像。这称为“光学切片”。再应用计算机的图像处置及三维重建软件。可以得到高清楚度来表示标本的外形剖面，十分机动、直观地进行形态学察看。

　　2、激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统

　　2.1ACASULTIMa312硬件及参数指标 激光光源：氩离子激光（50mW的紫外光、999mW的可见光），能同时/次序/分辨输出紫外光和可见光，激发波长为351-364nm；488nm；514nm。 计算机系统：80586/133MHzPCI/80MBRAM/2000MBSCSI硬盘/150MBBernoulli盘驱动器/17’’大屏幕显示器。 共聚焦系统：计算机主动把持光路准调节；盘算机节制孔径校准；计算机调节孔径大小；主动Z轴调节（Zui小0.1μm）。 光学探测体系：3个测窗式PMT采集荧光；1个CCD系统；12位的高速A/D转换器。 图像辨别率：图像大小1535×1535；像素Zui小间隔：0.1μm；灰度为4096级。 扫描方法：快速镜扫描DualScan台阶扫描；扫描精度0.1μm；扫描面积Zui大为10cm×8cm；扫描平面：XY和XZ和奇特点、线、面扫描。2.2激光扫描共聚焦显微镜软件系统

　　ACASULTIMa312系统采取奇特设计的软件将激光细胞仪与先进的盘算机技巧联合，发生快速、高效、机动的操作体系，完备的数据采集、剖析与治理功效。基于生物医学研讨有如下的软件。

　　ImageAnalyze—对于单色、比色和三色标志的二维荧光图像的定量分析，可产生透射光图像重叠，同时AutoImage可多个区域的自动扫描和荧光定量，以及雷同区域的时光次序扫描。 RatioAnalysis和Kinetics—测定细胞内的离子变更，可有点扫描、线扫描及图像扫描三种测定情势，以监测各种速率的生物反映。 Cell?CellCommunicationandFRAP-相邻细胞的FRAP分析。该软件首先用可光淬灭特异的细胞荧光，然后在多个时光点扫描，此扫描可对单一区域或细胞的多个选择区域，可发生透射光图像并与其它图像重叠。 CellList—储存被选择细胞的地位，即可自动对较大样品进行扫描，又可产生较小样品特异部位的网络地位表，以进行自动的测量、筛选和反复测定。 CellSorting—ACAS具备如下四种分选方式： AblationSort:预选定义一个荧光阈值，然后对特定细胞杀伤。②CookieCutterSort在用户定义的中心点四周切割Cookies。③QuickSort：对已定义的细胞表列，用Ablation或CookieCutter作分选。④ManualSort：直接使用鼠标把持载物台位置及激光脉冲，并杀灭和分选细胞，进行细胞显微外科，染色体切割和光隐阱等操作。 ConfocalImaging—共聚焦分析，可实现Z轴定量，三维立体图像分析（包含SFP模仿荧光处置法，DP深度投影法和SP文体投影法），以及视点移动动画。

　　3激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用

　　3.1定量荧光测量

　　ACAS可进行反复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及散布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体联合等生化反映水平。此外，还实用于高敏锐度快速的免疫荧光测定，这种定量可以正确监测抗原表达，细胞联合和杀伤及定量的形态学特征，以揭示诸如肿瘤相干抗原表达的准断定位及定量信息。

　　3.2定量共聚焦图像分析

　　借助于ACAS激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高辨别率、高敏锐度的二维图像。可得到完全活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特征的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变更进行正确的定性、定量、定时及定位分析。

　　3.3三维重组分析生物结构

　　ACAS使用SFP进行三维图像重组，SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度察看，也可以借助转变照明角度来突出其特点，发生更活泼真切的三维后果。

　　3.4动态荧光测定

　　Ca2+、pH及其它细胞内离子测定，应用ACAS能敏捷对样品的点，线或二维图像扫描，丈量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量剖析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反映，以及应用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。

　　3.5荧光光漂白恢复（FRAP）--活细胞的动力学参数

　　荧光光漂白恢复技巧借助高强度脉冲式激光照耀细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域四周的非淬灭荧光分子将以必定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接丈量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞构造及相干的机制。

　　3.6胞间通讯研究

　　动物细胞中由缝隙衔接介导的胞间通信被以为在细胞增殖和分化中起非常主要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，丈量由细胞缝隙衔接介导的分子转移，研讨肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通信的克制作用，以及胞内Ca2+,PH和cAMP程度对缝隙衔接的调节作用。

　　3.7细胞膜流动性测定

　　ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依附于荧光分子的旋转，而这种有序的活动自由度依附于荧光分子四周的膜流动性，因此极性测量间接反应细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反响测定和物种比拟等方面有重要作用。

　　3.8笼锁—解笼锁测定

　　很多重要的生涯物资都有其笼锁化合物，在处于笼锁状况时，其功效被封闭，尼康显微镜，而一旦被特异波长的瞬间光照耀后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢进程中施展功能。利用ACAS可以人为节制这种瞬间光的照耀波长和时光，从而到达人为掌握多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中施展功能的时间和空间作用。

　　3.9粘附细胞分选

　　ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分别筛选的剖析细胞学仪器，它对培育皿底的粘附细胞有两种分选办法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培育在特制造就皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何外形，而非选择细胞则因在八角形之外而被往除，该分选方法特殊实用于选择数目较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常幻想。（2）激光打消法，该方式亦基于细胞形态及荧光特征，用高能量激光主动杀灭不须要的细胞，留下完全活细胞亚群持续造就，此方式特殊适于对数目较多细胞的选择。

　　3.10细胞激光显微外科及光陷阱技巧

　　借助ACAS可将激光当作“光子刀”应用，借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元崛起切除等一系列细胞外科手术。通过ACAS光陷阱操作来移动细胞的渺小颗粒和构造，该新技术普遍用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。

　　4、结语

　　激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器，与传统的光学显微镜相比，大大地进步了分辩率，能得到真正具有三维清晰度的原色图象。并可探测某些低对照度或弱荧光样品，通过目镜直接视察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+、pH值，Na1+、Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标光源，对细胞动力学研究有侧重要的意义。同时激光扫描共聚显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的损坏，更接近细胞生涯状况参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是广泛显微镜上的质的奔腾，是电子显微镜的一个弥补，现已广泛用于荧光定量测量，共焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面，在全部细胞生物学研究范畴有着辽阔的应用远景。

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