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显微制片技巧
[楼主] 作者:水点点. 发表时光:2009/01/07 12:54
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显微制片技巧
一、粉末制片法
1．粉末的制备
选取有代表性的样品适量，剪成长约0.1cm的小段，置50~60℃的烘箱中干燥（含挥发油的药材温度应更低，把持在30~40℃），然后用粉碎器粉碎，常用的粉碎器有冲窝、铁碾、微型粉碎机等。粉碎后的粉末过50~60目筛，成药则应过100目筛，置清洁的瓶中备用。
制备粉末时应注意不得有其它的杂物混入，样品应全体过筛，不得留有残渣弃取，过筛后的粉末需充足混匀方可装片。
2．制片方式
依据须要不同，可作成临时或永久制片。
（1） 临时制片：作临时观察用，随用随作，通常仅能保留1~2周。直接封片法 不经任何处理，直接用于封躲液装片后即可观察。常用的封藏液有如下几种：
a． 水：常用蒸馏水。用于观察淀粉粒等多糖类物质，但易引起淀粉粒膨胀变形，欲测定粉粒大小时不宜用水作封藏剂。 b．稀甘油：用于观察糊粉粒、淀粉粒及其它多糖类物资，为显微制片中Zui常用的封藏剂。经水合氯醛透化的电影多加稀甘油一滴，还可防止水合氯醛结晶的析出。配制时应注意冬气象温低，粘度小，装片时易产赌气泡，可适当配浓一点，而夏天则相反，可配稀一点。 c． 50%甘油酒精：适用范畴同上，透明度较上者强。 d．甘油醋酸液：专用于观察淀粉粒的形态，是目前观察淀粉粒Zui幻想的封藏剂，可使淀粉粒坚持本来的状况而不膨胀变形，便于测定其大小。 e． 乙醇：重要用于观察菊糖及橙皮柑结晶。因乙醇易挥发，故装片后应立即观察，放置稍久则乙醇挥发产生大批汽泡。 f． 水合氯醛：一般作为透明剂，在观察菊糖时，用其作为封躲液，不加热，装片后立即观察，往往能得到比乙醇装片更为幻想的后果。方法：取干净载玻片，滴加封藏剂1～2滴，用解剖针或火柴杆挑取粉末少许与封藏剂混匀，然后用镊子夹住盖玻片的边沿中部或用食指及拇指拿住盖玻片的边沿，将其一侧边缘压在封藏液旁的载玻片上，慢慢放下至程度地位，用滤纸屑干净载片即可。
装片进程中应注意封藏液要适量，若不足则封藏液不能充斥盖片；过多则溢出盖片，使盖玻片浮动，并易将封藏液溢到盖玻片上面。盖玻片上面应干燥，不得将封藏液溢到上面，否则会污染物镜，并下降盖玻片的透明度，若已弄到盖片上面，则只能洗后重新装片，不得擦后委曲观察。
若封躲液不足未充斥盖片，可在盖片一侧边沿的载片上滴加少量的封藏液；若封藏液过多溢出盖片或引起盖片浮动，则用小滤纸条从一侧面汲取过多的封藏液，使盖片紧贴载片，不再浮动。
在盖片过程中，常因不熟练或不注意而在电影中留下气泡，可用解剖针将盖玻片一侧挑起，再轻轻放下，以除去气泡。另外，有的封藏液黏度较大（如甘油），不易渗透到细胞组织中，常在厚壁细胞腔中留下气泡，若先用少量乙醇润湿粉末，再滴加封藏剂装片，则可打消气泡。
水合氯醛透化妆片 用水合氯醛加热处理除去粉末中所含的淀粉粒、叶绿素、树脂、蛋白质、油脂、色素、挥发油等物质，并使细胞膨胀、透明，以利于细胞及组织的观察。方法如下：
取水合氯醛溶液1～2滴于载玻片上，挑取粉末少许，混匀，于酒精灯上微热透化，并以解剖针搅拌，弥补2～3次水合氯醛溶液（勿使溶液蒸干）透化好后加稀甘油1～2滴混合，盖片，肃清盖玻片四周过剩的药液。
（2） 特别处理制片a．漂白：若粉末中色素太多，色泽太暗，不便察看时，可预先用漂白剂浸渍处理，再以沸水及冷水洗涤，离心分别，然后挑取粉末适量，按前述方式制片。常用的漂白剂有过氧化氢、氯化碱液（碳酸钠与漂白粉混杂而成）等。
b．脱脂：一些含脂肪较多的中药（如种子类中药），即应用水合氯醛透化也不便察看，可预先进行脱脂，然后再按一般方式制片视察。脱脂办法有两种，一种是将粉末放于两层滤纸间挤压以往油脂，另一种是将粉末用某些溶剂（氯仿、乙醇－乙醚混杂液等）浸渍处置。
c．解离：若粉末木化组织较多，细胞彼此不易分离时，可用5％氢氧化钾浸泡几小时或在水浴中加热浸渍，使组织崩解后在制片观察。
（2）永久制片：粉末永久制片办法较多，这里仅简略先容离心管操作法制片。
脱水 取粉末0.3～0.5g，置离心管中，分步参加各级浓度的酒精进行脱水，每步三分钟，用细玻璃搅拌，每次均用离心机沉淀，倾去酒精，各级酒精浓度依次为30％、50％、70％。
染色 于70％酒精脱水后的粉末中参加番红染液剂，搅匀，染色30min，花类、叶类及单子叶植物药材可将染色时间缩短为10～15min。离心分别，去上层染液，沉淀用70％酒精洗涤。染好的粉末逐步用80％、95％、100％的酒精脱水，每步5min。
透明与封片 粉末逐步用25％、50％、75％、100％的二甲苯透明，每步3min，搅拌，离心分离。去上层二甲苯液，速参加加拿大树胶（预先用二乙苯溶化好）约0.5～1ml，用玻棒搅拌均匀。用吸管汲取一滴于载玻片上，加盖玻片封藏，并贴上标签，低温防尘干燥即可。
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[楼主] [2楼] 作者:水点点. 发表时间: 2009/01/07 12:56
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中药显微化学辨别法
显微化学是一种极敏锐的定性化学鉴别方法，由于应用了显微镜，故能够视察到在肉眼看来几乎是完整隐藏的反应，从而大大增添了反应的敏锐度，正确地检讨出显微组织切片中一系列不同地物质，这是一般化学鉴定方法所不能做到的。通常显微化学的方法都是极其简略、精练，同时又是确实可信的。中药显微化学辨别即是应用显微化学的方法来决议细胞壁及其内含物的化学物资，或辨别组织构造，从而到达鉴别中药的目标。
一、 试验方法
1．药材切片或粉末实验法
将药材切片或粉末置于载玻片上，滴加恰当试液，加盖玻片，在显微镜下视察发生的结晶或沉淀，以及特别的色彩反响等。若为切片，还须要察看反映的部位，用确认加入反应的成分在组织中的散布。
供作实验的切片一般是用徒手切片。切片应稍厚，约在20～40um之间，若太薄则可能因所要观察的内容物含量太少，而不易显示出明晰的成果。对于干药材，切片前常需经过各种软化处理，但应注意，所进行的处理应对要检查的成分无影响，如检查菊糖或粘液质时不能用水处理，检查挥发油时不能用高浓度的乙醇或蒸煮法处理，检查钟乳体不能用醋酸处理。
2．浸出液实验法（显微结晶法）
取药材粗粉加适当溶剂浸渍，用吸管汲取浸出液，滴加一滴于清洁的载玻片上，在其旁边再滴加反应剂一滴，用玻棒尖端沟通此两滴溶液，注意勿搅和此溶液（若直接将试剂加到浸出液上，则可能因反应过快而析出极细小的结晶），放置片刻，加盖玻片，于显微镜下观察两滴溶液接触处形成的结晶，注意结晶的外形及颜色。
3．微量升华法
应用中药中所含的某些化学成分在必定温度下能升华的性质，获得升华物，在显微镜下观察升华物得外形、颜色等。必要时可用显微熔点测定仪测定结晶得熔点。此外，还可以进行一些化学反应，作为辨别特点。
方法：取一与载玻片大小雷同的金属片，放在有圆孔的石棉板上，金属片上放一高约0.8cm，直径约1.5cm的小金属圈，对准石棉板的圆孔。圈内放药材粉末适量，展成一均匀薄层，圈上放一载玻片。在石棉板圆孔下用酒精灯缓缓加热，至粉末开端变焦，载玻片上有升华物凝结时，去火冷却。取下载玻片，反转后放于显微镜下观察或加适当化学试剂，观察其变更。对于含水分较多的药材。则应为稍加热，待水分挥发后再盖上载玻片，获取升华物。
若没有以上装备，可改用一简化方法：即在一载玻片上放上药材粉末，展成一薄层，在载玻片两端各方一段小玻棒或火柴杆，再盖上一载玻片，下面用酒精灯加热升华。
1．细胞壁
植物细胞壁重要组成是纤维素，它形成了细胞壁的框架。由于环境的影响及细胞生理性能的不同，在纤维素框架中经常存积有其他物资，使细胞壁产生各种不同的特化，如木质化、木栓化、角质化、粘液化、硅质化、几丁质化等。
（1）纤维素细胞壁：在纤维素细胞壁中，纤维素常与半纤维素同时存在。纤维素是一种化学性质比拟稳固，能耐酸、碱及其他多种溶剂的多糖类物质，由链状系列的葡萄糖基通过氧原子的相互联合而成。从构型上来看，纤维素很像直链淀粉，但纤维素的单糖单位为β-葡萄糖，且分子量较淀粉大。
细胞壁纤维素框架的基础组成单位是一些是非不等的链状纤维素分子，这些分子有规矩地平行排列，凑集在一起，称微团。由微团组成一种丝状的微团体系，称微纤丝，这种构造可在电子显微镜中看到。微纤丝又集合成较粗的纤丝，称为大纤丝，大纤丝在光学显微镜中即能看到。由于纤维素分子有规矩的排列成晶格状，使纤维素细胞壁具有相似晶体的性质，在偏光显微镜下可显出强烈的各向异性。
纤维素细胞壁常见的显微化学反应有如下几种。
铜氨溶液反应 于材料中加新配制的铜氨溶液，纤维素细胞壁逐渐膨胀而后溶解。纤维素在一般溶剂中都不溶解，但可溶于铜氨溶液。
碘－硫酸反应 滴加一滴1％碘液于材料中，再加一滴66.5％硫酸，纤维素细胞壁呈蓝色，细胞壁中纤维素越多，其他成分愈少，则反映愈显明，对于木质化强烈的细胞壁，反响被掩饰不能看出。
氯化锌碘液反应 材料加氯化锌碘液一滴，纤维素细胞壁被染成紫色（木化或栓化细胞壁被染成黄色或棕色）。此为目前检讨纤维素细胞壁Zui常用的反应，在大多数情形下，氯化锌碘液较碘－硫酸更为有效。
（2）木质化细胞壁：木质化细胞壁是由于细胞壁纤维素框架中沉积了大批木质素所致。木质素是丙酸苯脂类的一种聚合物，由于它的沉积，可使细胞坚硬坚固，增添植物支撑重力的才能。
木质化细胞壁常用的显微化学反应有如下几种：
硫酸苯胺反应 加硫酸苯胺试液一滴，木质化细胞壁被染成鲜艳姜黄色。为了避免细胞中含的草酸钙结晶被溶解，可改用醋酸苯胺试液，亦显黄色。这种色彩较为稳固，可制成永久制片。
间苯三酚反应 加间苯三酚1～2滴使材料湿润，稍放置或微热后，加浓盐酸一滴，木质化细胞壁被染成红色或紫红色。色彩的深浅视木化水平而定。此为检讨木质化细胞壁Zui常用的反应。有时但用盐酸即可使细胞壁发生红色或紫红色，这表明细胞壁本身就含有间苯三酚类化合物。
高锰酸盐反映 将切片放进盛有1％高锰酸盐的小杯中放置5分钟，切片被染成棕色。倒出溶液，换水洗涤切片，将切片移至稀盐酸中至几乎完整褪色为止。取出用净水洗涤，置于载玻片上，滴加一滴氨液，木质化细胞壁呈鲜红色。这种反应对双子叶植物十分显明，对裸子植物的组织不起反响，单子叶植物往往只能发生黑褐色。
（3）木栓化和角质化细胞壁：木栓化喝角质化分辨是在细胞壁中渗透了木栓质或角质的成果，通常是植物维护组织细胞壁所具有的特化情势。木栓质和角质均为高分子脂肪酸的聚合物，二者性质类似，其显微化学反应亦基础一致。
氯化锌碘液反应 木栓化及角质化细胞壁被染成黄色或棕色。木质化细胞亦能显同样的颜色，但切片若预先用次氯酸钠消毒液处理1～2小时，则木栓化及角质化细胞壁染成黄色，木质化细胞壁染成紫色。
苏丹红Ⅲ染色 切片加苏丹红Ⅲ试液，稍放置或微热，木栓化及角质化细胞壁均显桔红色、红色或紫红色。再加20％氢氧化钠，呈，加热则木栓质溶解呈黄色滴状，而角质化细胞壁不转变外形。
（4）粘液化细胞：为细胞壁中纤维素等成分产生变更而成为粘液，此粘液在细胞表面常呈固态，吸水膨胀后则成粘滞状况。粘液化细胞壁遇玫红酸钠醇溶液呈玫瑰红色，遇钌红试液呈红色。
（5）矿质化细胞壁：细胞壁中沉积了硅质或钙质所致，其中以硅质（二氧化硅）为常见，硅质不溶于醋酸、硫酸或硝酸，可溶于氢氟酸中。
（6）几丁质化细胞壁：几丁质为β－1，4乙酰胶基葡萄糖型直链多糖，存在于低等植物细胞壁中，此种细胞壁常被误以为纤维素细胞壁，但其折色光性强，不与氯化锌碘液反应。
切片加50％碱性溶液，在160～170℃下加热一小时，几丁质分解，分解产物可溶于3％的醋酸溶液中。
[楼主] [3楼] 作者:水点点. 发表时光: 2009/01/07 12:56
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中药显微技术-2 徒手切片法
二、徒手切片法
徒手切片法主要用于临时制片。因切片进程中没有经过庞杂的化学处理，可以真实地反应植物细胞、组织的原来面目，在显微化学及一般的构造观察中极为有用，因此必需熟练控制这么技巧。
1．切片工具
（1）切片刀：一般应用普通的有柄剃刀，这种刀使用时光较长，每次用前在磨刀上磨至锐利即可。若没有剃刀，也可用刀片取代，市售刀片有单面合双面两种，以单面刀片为好，特殊是切较硬的资料。
（2）培育皿：用于盛片，切片前先装适量净水（对较坚硬的材料）或30％乙醇（对较柔软或含黏液、菊糖等的材料），乙醇浓度也可更高，但不易超过50％，否则易引起细胞压缩。
（3）羊毫：用于取片，小楷和中楷羊毫均可。
（4）切片板：木板或玻板，压切法用之。
（5）夹持物：夹持物应是牢固而易切的材料，常用的有莴苣、萝卜、土豆等，用于夹持柔软的材料，如叶、花瓣及渺小的须根，接骨木髓、通草等，适用的范畴同前。通草遇水即软，故不能与水接触，可将其保存在酒精中作切片，对于在酒精中保留的材料，用通草作夹持物甚好；软木或杉木，用于较硬的材料假如实、种子类，用前需软化。
2．材料的软化
对于新颖的材料，多数无需软化即能进行切片，但中药大多数都为干材料，切片前必需经过软化处理。软化的方法较多，使用时应依据材料的性质加以选择。
（1）热水浸泡法：将材料放入60℃左右的温水中浸泡数小时即可。本法实用于纤细的根茎及根、全草、叶、花等质软而细薄的材料。
（2）水煮法：材料放入沸水中煮一段时间，软后取出。本法适用于较硬的根、根茎、茎木类，皮类等材料。对于特殊坚硬的材料可放入压力锅中煮，若采取骤冷骤热的方法（材料在沸水中煮一段时间，取出投入冷水中冷却，再投入沸水中煮，如此重复进行，直至软化），可缩短软化时间。
（3）醋酸煮沸软化法：材料置5％醋酸水溶液中，于微火上煮沸数小时候后，再换净水煮或温浸至材料全体透软而醋酸味即可。本法实用于坚硬的木化材料。注意勿使煮沸时间过长否则材料涨裂。
（4）甘油蒸煮法：材料用甘油浸泡后，将材料连同甘油一起放入隔水锅中蒸煮，直至软化，电子显微镜价格。本法使用于坚硬的木化材料。
（5）湿气密封法：取玻璃干燥器一个，于干燥器底部放温水约至2/3高（不放干燥剂），但不的超过孔磁板，于磁板上展一层湿润的纱布，将材料切成小块，放在纱布上，加盖密闭，然后将干燥器放在温箱内，保温45℃左右（若在夏天则不必放在温箱内），一般经过2～10天即可软化。本法软化时间较长，但它能保证细胞内含物的完全，使细胞内含物不会因洗涤、升华或过火膨胀、粘液化等现象而受丧失。对于作显微化学研讨，特殊是含淀粉粒、菊糖、粘液质等的材料的软化尤为主要。
（6）甘油－酒精软化法：材料先用水煮，除往内部气体，以免妨害软化剂的渗透。冷却后投进50％的甘油－酒精等量混杂液中浸泡数天至数星期，直至软化。
（7）氢氟酸软化法：材料先用骤冷骤热法处理2～3个小时，冷却后放入市售浓度的氢氟酸（37％～40％）与水各半混合液中，经一个星期至一个月左右可软化完全。本法使用于某些极硬的材料（假如实、种子类药材）的软化。
3．切片 软化好的材料经分割成适当的大小后即可切片，切片方法有如下几种：
（1）手执法：用左手拇指和食指夹住材料，并用中指托着，使材料略高出拇指和食指，右手持刀，使刀刃与材料的的切面平行，移动右臂，以稍微均匀的动作斜斜向后拉切。切片过程中不得造成短促而续断的动作，更不得往返拉切，标本必需一次切下，否则将得到厚薄不均得切片。刀刃及材料切面应经常用水或30％乙醇润湿，以防止材料的干缩以及避免切的薄片粘在刀刃上不易取下。切片用蘸水或30％乙醇的毛笔从刀背拂下，放入培育皿中。
（2）夹持法：取夹持物切成恰当大小，然后纵向剖开（但不完全切开），将材料夹入，再按前法即夹持物和材料同时切下，除往夹持物即可。本法实用于叶片、花瓣、细小的须根等质软而不便手执的材料。对于渺小的果实、种子类药材，应将夹持物完整剖开，并在中心挖一个小洞，放进资料，再合上夹持物进行切片。
（3）压切法：将材料放于切片板上，以左手中指及食指轻轻压住材料，右手持刀自左向右或自上而下均匀用力切削。本法所用切片以单面刀片为好。切片进程中应尽量避免刀刃与板相撞。本法对于渺小的果实、种子类，以及某些较硬的材料尤为适用。
4．装片
用羊毫挑取透明的薄片（形状并不请求十分完全），放于载玻片中央，于低倍镜下观察（不用盖玻片），若切片充足透明，可以看清个别细胞，则取下滴加1～2滴封藏剂或水合氯醛透化后再加封藏剂，盖上盖玻片即可。
[楼主] [4楼] 作者:水点点. 发表时间: 2009/01/07 12:57
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三．表面制片法
1．资料的预处置
（1）鲜材料：用刀片剪下所需的部位，成适当大小，用清水冲刷一次。若不马上用，可泡于30％酒精中防腐保存。
（2）干药材：先用冷水浸，再用温水浸，必要时可煮沸，至能展开恢复原样即可。若是较硬的材料（假如实类），还经过软化处理。然后分割成适当大小。
2．办法
（1）撕取法：一般用于表皮易于剥离的叶的表皮制片。
取出材料，认清高低表面，用刀片在表面轻轻划一刀（不能划断叶片），或从上面等分地将叶往下折迭，再用下镊子从裂缝处撕取表皮。对于表皮不易与叶肉组织分别的，可借助刀片，边撕边切割。撕得的表皮置于载玻片中心，表皮的外表面朝上，用锐利的刀片切去带绿色叶肉部分的表皮，加稀甘油封片即可。
（2）削取法：对于表皮难于剥离的材料（如多数植物叶的上表皮、果实的外表皮、草质茎的表皮等）可采取削取法。
用左手拿住材料，右手持刀（与徒手切片雷同），使刀与材料表面平行，移动右臂，轻轻切削，得表面一层薄片。放于载玻片中心，切割成适当大小，加水合氯醛透化处理，然后以稀甘油装片即可。
（1） 解离法：重要用于表面不易剥离的叶的表面制片。
将材料切割成适当大小，放入5％KOH（或NaOH）溶液中浸泡1～2日，也可稍加热以缩短时间，至表皮易于剥离时，取出。用清水冲刷2～3次，再照撕取法制片。
（4）整体透化封固法：适用于扁平而薄，难于撕取表面的叶片、花被片等的表面制片。
将材料切割成恰当大小（0.5×0.5cm）的小块，置于载玻片中心，用水合氯醛透化处置，至材料透明后用稀甘油装片即可
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