一、光学
显微镜油镜的应用和维护法：
由于细菌体积渺小，故在细菌的形态学研讨中，经常须要借助显微镜油镜，才干比拟明白地进行视察。因此，同窗们必需熟练地控制油镜的应用及维护法。
（一）油镜头的辨认：
各接
物镜的放大率可由其外形识别，镜头长度越大，镜片直径越小，放大倍数大；反之，放大倍数小。油镜头长度大于低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线或白线，并刻有100×、1.25或oil等字样。
（二）油镜的使用法：
1、
使用显微镜油镜时，必需将显微镜端正派立桌上，不得将镜臂曲折，使载物台倾斜，以免香柏油流溢，影响观察，污染台面。
2、对光：
采取自然光为
光源时，宜用平面反光镜；若用人工灯光时，则用凹面镜。
首先打开光圈，转动反光镜，使光线集中于集光器。可依据须要，高低移动集光器和缩放光圈，以获得Zui佳光度。
一般用低倍镜或高倍镜察看物象或用油镜检讨不染色标本时，需降落集光器并恰当地缩小光圈，使光度削弱；若用油镜检讨染色标本时，光度宜强。应将
显微镜亮度开关调至Zui亮，光圈完整打开，集光器上升至与载物台相平。
3、调焦距：
A、将标本片放载物台上，用标本推动器固定，将欲检部分移至接物镜下。先用低倍镜找出标本的地位，然后进步镜筒，在标本的待检部位滴镜油一滴，再换油镜观察。
B、转动粗调节器使载物台渐渐上升（或使镜筒渐渐降低），直至油镜头浸没至油中。此时眼睛应从侧面观察，以免压碎标本片和破坏镜头。
C、然后双眼移至接
目镜，一面从接目镜观察，一面反方向迟缓地转动粗调节器（降落载物台，或上升镜筒），当呈现含混物象时，换用细调节器，转动至物象清楚为止。
D、观察完毕，应先进步镜筒，并将油镜头扭向一侧，再取下标本片。油镜头使用后，应立即用擦镜纸擦净镜头上的油。若镜油粘稠干结于镜头上，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，并随即用干的镜纸擦去残存的二甲苯，以免二甲苯渗透，溶解用以粘固透镜的胶质物，造成镜片移位或脱落。
（三）油镜的使用原理：
油镜的透镜很小，光线通过玻片与油镜头之间的空气时，因介质密度不同，产生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象浮现不清。若在油镜与载玻片之间参加和玻璃折射率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515），则使进入透镜的光线增多，视野亮度加强，使物象明亮清楚。
（四）显微镜的保护：
1、显微镜是精密仪器，使用时要注意爱惜，切勿随便拆卸和碰撞。
2、强酸、强碱、氯仿、酒精、乙醚等都能往漆或破坏机件，均需注意不使接触显微镜。
3、细调节器是显微镜Zui精致、Zui懦弱的机械部分，每旋转一周使镜筒上升或降低0.1毫米，只能往返回转，即向一个方向转动数周遇阻力时，应反方向转动。
4、不用时将接物镜转成“八”字形，载物台降至低点，降落集光器，关上光圈，套上维护罩，双手平托送回。
5、
显微镜使用进程中，如发明问题应及时向老师报告并进行登记，以便检验。
二、细菌的染色检查法
一般染色法分为单染色法和复染色法。单染色法只用一种染料使细菌着色，可明白观察细菌形态，但不能辨别细菌。复染色法是用两种以上染料进行染色，有协助辨别细菌的作用，故又称为辨别染色法。复染色法种类很多，重要有革兰染色法和抗酸染色法。
（一）细菌涂片的制备
作细菌染色检讨，首先要制备细菌涂片。制备细菌涂片一般包含涂片、干燥、固定三步。
1．涂片：取干净玻片一张，按以下步骤操作
肉汤培养物涂片：
① 右手拿接种环的玄色胶柄部分，左手托持试管。
② 接种环以15°角置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌，直至金属丝烧红(图1-3)，然后将金属柄部也盘旋通过分焰烧灼灭菌。
③ 用右手小指和手掌小鱼肌侧拔掉左手所持试管的棉塞，并立即火焰烧灼试管口灭菌。
④ 用已灭菌冷却的接种环伸进试管中取出菌液(图1-4)。注意勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口。
⑤ 再次灭菌试管口，将棉塞在火焰上略加烧灼（时光要短，以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。
⑥ 将接种环上之菌液涂于载玻片上，制成的菌膜直径约1cm左右。然后将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀逝世残留的细菌。液体标本（如脓液、痰液等）均可照此法涂片
斜面培养物涂片：
用细菌斜面（或平板）培养物涂片，需预先取一接种环无菌生理盐水置于载玻片上，然后再按上述无菌操作法从斜面培养物上取少量菌苔，放入生理盐水内轻轻研匀，制成直径lcm左右的菌膜。
如有多个标本行同一办法染色时，可用蜡笔在玻片上划出数格，做好标志再分辨进行涂片，以免混杂。
2、干燥：
涂片Zui好在室温中自然干燥，如需加速干燥，可将标本向上警惕地放置离火焰半尺高处，略烘促使干燥，切不可在火焰上烧干。
3、固定：
常用加热固定法。涂片干燥后，让玻片有菌膜的面向上，在火焰的Zui热部分敏捷通过三次。固定之目标是使细菌蛋白变性，菌体坚固黏附于玻片上，还可杀逝世细菌，转变菌体对染料的通透性。
以上步骤完成后，便可进行各种染色。
（二）革兰（Gram）染色法
革兰染色是细菌学中应用Zui普遍的一种染色方式，籍此染色法，可将所有细菌区分为两大类。
【材料】金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli，E．coli)24h斜面培养物、革兰染色液、生理盐水、载玻片、接种环等，
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【方法】
1、初染：玻片菌膜上滴加结晶紫染液1～2滴，染色1分钟，用细流水冲冼剩留染液，甩往片上积水。
2、媒染：加卢戈碘液处置1分钟后细流水冲刷，甩往积水。
3、脱色：加95％酒精2～3滴，轻轻动摇玻片，使脱色均匀，一般处置约30秒左右，细流水冲洗，甩去积水。
4、复染：加稀释石炭酸复红液1～2滴，染30秒钟，细流水冲刷，待干或用滤纸吸干，油镜察看。
【成果】葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性，以G+表现；大肠杆菌染成红色，称革兰阴性，以G-表现。
【注意事项】
1、脱色是革兰染色中的要害步骤，脱色过度，可使G+菌被误染为G- 菌；脱色不够，则G- 菌可被误染为G+菌。脱色时光的是非还与涂片厚薄有关，一般以涂片薄而均匀为好。
2、G+菌与G- 菌的染色反映，还受多种因素如菌龄、染色时光、pH等的影响，只有严厉正规操作，才干得到准确结果。
【附录】
革兰染色液的配制
1、结晶紫染液
① 结晶紫酒精饱和液：取14g结晶紫溶于100ml 95％的酒精内。
② １％草酸铵水溶液：草酸铵0.8g溶于80ml蒸馏水中。
③ 将已配好之①液20ml和②液80ml混杂即成，置瓶中备用。
2、芦戈（Lugol）氏碘液
① 碘 1g；碘化钾 2g ；蒸馏水300ml
② 先将碘化钾2g溶于100ml蒸馏水中，再加碘1g，用力摇匀待溶解后，加蒸馏水至300ml即成。供革兰染色媒染用。
3、95％酒精
4、石炭酸复红稀释液
①石炭酸复红染液：
取碱性复红酒精饱和液（95％酒精100毫升中加碱性复红10g）10ml，与5％石炭酸水溶液90ml混匀即成。
②稀释石炭酸复红染液：
将上述石炭酸复红染液用蒸馏水稀释10倍即成。
上述各种染液配成后，均需用滤纸过滤后使用，染液应贮存于棕色瓶内。
（三）抗酸染色法
【方法】
（1）在制好的涂片标本上滴加石炭酸复红液3-4滴，用木夹夹住玻片一端，在酒精灯上渐渐加热，使染液冒蒸汽，但不能煮沸，并随时添加染液，使不要烤干，保持5分钟。
（2）待玻片冷却后，水冲刷 。
（3）用3%盐酸酒精脱色至涂面无色为止，用流水轻轻冲洗。
（4）加美兰染色液 1-2滴，复染30秒-1分钟，水洗干燥，镜检。
【成果观察】
抗酸细菌（如结核杆菌）呈红色，其它细菌及背景物资均为蓝色。必需逐一观察各个视野，直到全体涂片找不到结核杆菌时，才可报告阴性。
三、细菌的接种技巧和培养办法：
（一）细菌的接种技巧
接种技巧一般分为分别培育接种法和纯种细菌接种法。
1、分别培养接种法---平板划线法：
被检资料如粪便、痰、脓汁、尿液、脑脊液等常混淆有多种细菌，平板划线法可使混淆的细菌在琼脂平板表面疏散生长，各自形成不同的菌落，再根据菌落的形态特点，挑选单个菌落持续培养，以此分别获得纯种细菌，用于进一步研讨、鉴定或保留。
平板划线的方式依据待检标本中细菌的数目来选择，可分为平行划线法和分区划线法两大类。
【资料】葡萄球菌和大肠杆菌混杂菌液、普通琼脂平板。
【方法】
（1） 平行划线法：
常用于含菌量较少的标本。
①烧灼接种环，待冷，取一接种环菌液。左手斜持平皿（450角），用拇指打开皿盖，使其与皿底间离开成2～3cm宽的缝隙，靠近火焰四周，右手握持沾菌之接种环伸入皿内，在平皿上端1/6范畴往返划线，密集涂布。
②烧灼接种环，待冷后（是否冷却可在平板培养基边沿无菌处接触一下，若琼脂溶化表现尚未冷却），通过原划线处作持续平行划线（如图2-1A）。划线时使接种环与平板成300～400角，轻触平板，用腕力将接种环在平板表面行轻快的滑移动作往返划线，划线间距恰当，不能重叠，接种环也不能嵌进培养基内划破琼脂表面，并注意无菌操作，避免空气中的细菌污染。
③接种完毕后，盖皿盖，将接种环火焰灭菌后放回，用记号笔在皿底玻璃上注明标本名称，接种者班级、姓名、日期等，将造就皿颠倒（平皿底面朝上，以避免培育进程中凝结水自皿盖滴下），送进温箱。
④经37℃18～24小时孵育后取出，察看琼脂平板表面细菌生长情形，注意菌落的特点。
（2） 分区划线法：
常用于含菌量较多的标本。
①同上法通过原划线处作衔接平行划线，划线范畴占平板的1/3～1/5；种毕, 旋转平板，接种环用火焰灭菌，冷却，再通过前一段划线在平板另1/3～1/5面积内作持续平行划线；如此反复3～5次。
②接种完毕后，盖皿盖，接种环火焰灭菌后放回。同上在皿底玻璃上注字后，将培养皿颠倒，送进温箱培养，37℃18～24小时后取出，视察菌落特点。
2、纯种细菌接种法
依据培养基的物理性状，纯种接种法有斜面培养基接种法，液体培养基接种法和半固体培养基接种法三类。
【资料】葡萄球菌或大肠杆菌18～24小时斜面培养物各一支、固体琼脂斜面培养基、肉汤培养基、半固体琼脂培养基。
【办法】
（1）固体斜面造就基接种法：
①左手握持菌种管与待种培养管的下端，使斜面部向上，两管口平齐。在火焰旁，以右手手掌与小指、小指与无名指分辨拔取并夹持两管棉塞，并将两管管口敏捷通过分焰灭菌。
②右手执接种环（姿态与握铅笔类似）火焰烧灼灭菌，欲伸入试管内的接种杆部分，亦要通过火焰3次以杀灭其表面的杂菌。灭菌过的接种环要握持手中，勿再碰及其它物品。
③将灭菌并已冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取菌苔少许，退出菌种管，再伸进待种管中，自斜面底部轻轻向顶端划一直线，然后自下而上沿斜面蜿蜒划线，注意划线时勿划破培养基表面，沾菌的接种环，进出试管时，均不应触及试管内壁。（如图2-2）。
④接种完毕，两管管口敏捷通过火焰2～3次，塞回棉塞，并以右手拇指、食指分离将两管棉塞转进至本来地位。接种环灭菌后送回。接种管注字后37℃孵育18～24小时后观察生长情形。
（2）液体造就基接种法：
基础上同固体斜面接种法，不同处，仅在取菌后，接种环应在液体培养基管接近液面的管壁处轻轻研磨均匀，然后将试管稍倾斜，使菌种混匀于肉汤中即可。
（3）半固体培养基接种法：
①同上法握好菌种管及半固体培养基管。
②右手握持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔，垂直刺入半固体琼脂培养基的中心，可刺达近管底处，但不触及管底，然后循原路退出。
③接种毕，管口通过分焰灭菌，塞上棉塞，接种针灭菌后放回。
上述纯种细菌接种后，均要在试管上注明菌名、接种者姓名、日期，送进37℃温箱，培养18～24小时后视察生长情形。
四、细菌抗衡生素的敏感性实验---纸片扩散法
又称Bauer-Kirby法。是将干燥的浸有必定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种必定量某种细菌的琼脂平板上，经培育后，可在纸片四周呈现无细菌生长区，称抑菌圈。丈量抑菌圈的大小，即可判定该细菌对某种药物的敏感水平。体外药敏成果可作为病人治疗选用药物的参考。
【材料】金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌18～24小时培养物、普通琼脂平板、小镊子；含有青霉素、庆大霉素、红霉素、复合磺胺、链霉素等抗生素的干燥滤纸片。
【方式】
1、将金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌培养物密集均匀地涂布全部平板。
2、将含有抗生素药物的滤纸片用烧灼灭菌的镊子分辨贴于平板表面，相互间应间隔必定间隔。
3、37℃培养24小时后，观察结果。
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