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　　加入少量胰酶清洗，弃往后，加入胰酶2－3ml，培养箱内放置3min左右，取出，加入培养液中和胰酶，轻轻吹打即可。

　　ECV－304培育条件同时。操作的时候步骤基础雷同，只是参加胰酶消化的时光比Bel-7402稍微长1－2min。

　　同样是新手上路，被我弄逝世的细胞也不少。还盼望大家多指教。

　　我曾经养过几种细胞，包含卵巢癌的和宫颈癌、胰腺癌等，其中重点做的卵巢癌的细胞，扼要说一下。我所用的卵巢癌的细胞包含SKOV3、A2780、3AO、OVCAR3、HRA，几种细胞的特征不完整一样，但是我的传代的步骤是基础一致的：细胞生长至80%会合时传代，先倒掉培养液，加预先加好双抗的生理盐水或PBS 5-10ml（100ml培养瓶）后轻轻摇摆数次后倒掉，加0.25-0.35%的胰酶2ml，并使其散布均匀（这一点很主要，必定要注意工作台是否平整，否则容易造成胰酶散布不均匀而细胞消化不同步），待细胞间隙变大时终止消化，加含10%血清的培养液（我用的是1640）4ml柔柔吹打，再依照需传代的比例（1：2或1：3）补足培养液后分装至2-3个培养瓶中。若细胞碎片较多，可在消化后不倒掉胰酶直接加含血清的培养液吹打后500rpm离心5min，再用培养液重悬分瓶。消化所需的具体时间依细胞的种类和状态而定，也和细胞的会合水平有关，一般是80%会合时Zui容易消化，若细胞长得太满，消化时光要恰当延伸，必要时可以将培养瓶移至培养箱内消化。另外，一次性培养瓶要比玻璃培养瓶所需的消化时间稍长。

　　胰腺癌细胞我所养的是CAP，感到不太好伺候，尤其是传代时很艰苦。我一般是在倒掉培育液后，加生理盐水或PBS冲刷，而后加一次胰酶作用3-5分钟，倒掉胰酶，再加2-3ml新的胰酶持续消化，这样加两次的后果好一些，但是吹打的时候还是很艰苦，总感到细胞的贴壁才能太强了，明明看见细胞已经变圆了，可就是吹不下来。现在想想可能在胰酶中加EDTA会好一些。

　　相比而言，还是HELA好养，细胞的状况一直不错，而且消化时也很轻易。

　　养过好几种细胞，不过还是B16养的时间Zui长，心得领会也比拟多。说一下我的经验和教训。正如drake015 斑竹所言：细胞增殖快非常好养，但是要及时换液，否则也很容易逝世亡、或变形。我养的Zui好的时候，天天都在换液，两三天就要消化传代。我用的消化液一般是 消化用含EDTA的胰酶0.25%，个人感到后果比拟好一点。

　　消化步骤：吸出培养液，加入PBS洗涤（视培养瓶大小加入相应的量，25CM加入1-2ML）而后加一次胰酶（25CM培养瓶加0.6ML）作用2-3分钟，轻轻摇摆使均匀作用在细胞层面上。要一直在显微镜下视察，以防消化过火，等细胞从梭形变成椭圆形（或是棱角变钝），原来连成片的细胞之间开端有小小的空间，细胞与细胞好象是一粒粒的，界线明白，这时是消化的Zui佳机会。（细胞的活气Zui好，又非常容易吹打）加入培养液进行吹打十几次即可。

　　假如消化到细胞全体飘起来，就消化的稍微有点过了。假如细胞的形态还是老样子，就消化的有点不足，吹打起来十分费力，有大片的细胞就会贴在壁上，起不来，而且很不均匀。只好重新加胰酶消化。

　　还有就是细胞长的比较密时，胰酶可以比平时多加一点，消化时间恰当延伸。

　　怎么没大有养CHO细胞的啊？

　　我养的是CHO细胞，中国仓鼠卵巢细胞。

　　1、培养液用的GIBCO的RPMI-1640。里面加10%小牛血清，青霉素+链霉素。消化时用0.25%胰酶。

　　2、我都是1640配养分液时现加血清和双抗，血清分装后直接由-20度到37度水浴箱中溶掉，没发现血清有沉淀现象。总体积100ml的培养液：90ml1640+10ml牛血清+1ml双抗，无其他物资了。培养进程中没发现有什么问题。

　　3、传代时，先吸掉培养液，我都不用倒掉的办法，怕由于瓶口而污染，都是慢慢吸管吸出的。然后培养液略微冲刷一下，加胰酶，颠倒显微镜下见80%细胞变圆后，吸出胰酶，培养液终止消化。吹打下细胞，按所需稀释比例传代。我现在的CHO细胞状态不是很好，但是疯长，不知道为什么。所以每次传代时，我都是留一滴足够，差未几能稀释20倍了。不知哪个战友也养CHO细胞，多交换。

　　我也来谈谈PC12和WHBLWQ有些不同 ,不知WHBLWQ 的是为分化还是分化型的.

　　细胞起源:上海药物研讨所. 分化型PC12.

　　传代时首先参加1ml0.05%胰酶,轻晃,将细胞浸过后马上倒出 ,可往除状况不好的细胞,再加入1 ml胰酶,程度摇摆,保证胰酶与细胞均匀接触,3-4min后肉眼可看到瓶底有膜状细胞纷纭掉落,至瓶底无膜状物时到入8-10ml1640(+10%NBCS)终止消化,倒入离心管,用1ml移液器奏乐70次左右(各人用力不一吹打次数有出进),胎盼蓝染色存活率>95,是个很好的措施!!!

　　用过0.25%胰酶,细胞大片浮起逝世亡率极高!!

　　当用不同批次配的胰酶必定要做预试后在正式应用.

　　我来说说FRTL－5细胞的培养：

　　在F-12培养基中加入5％小牛血清、10mU/ml TSH、10µg/ml胰岛素、5µg/ml转铁蛋白、10ng/ml生长抑素、0.4ng/ml氢化可的松、10ng/ml甘氨酰－组胺酰－赖氨酸醋酸盐，每100ml培养液加入1ml双抗，用2

　　00ml培养瓶置CO2孵箱35℃培养。每4天换液一次。待细胞有80％融会时进行传代。大约7－10天传一代。 将生长状态良好、有80％融会的FRTL-5细胞弃培养液， 0.2％EDTA：0.25％胰蛋白酶1：3的消化液大约3ml加入200ml培养瓶中，待有大面积细胞脱落时，加入培养液终止消化。用吸管轻轻吹打几下就可以成单细胞悬液。分装入两个培养瓶，传代完成，中间不须要离心。假如过早中断胰酶作用，很难吹打成单细胞悬液。

　　（基底动脉平滑肌细胞原代培养）

　　1：培养液：MEM(GIBCO)，20％FBS，双抗100IU／ml；

　　2：原代细胞培养：取5kg左右兔空气栓塞法正法后断头，于无菌条件下从枕大孔处用大止血箝扳开颅骨裸露并警惕取出脑组织放入装有DMEM的培养皿中，用眼科镊分别基底动脉后按惯例平滑肌方法贴块培养。

　　3：传代:我的步骤是

　　（1）吸除培养瓶内旧培养液。（2）D-Hanks液冲刷2遍。（3）加入消化液少许，以能笼罩瓶底为限。（4）颠倒显微镜察看发明细胞胞质回缩、细胞间隙增大时，立即终止消化。（5）吸除消化液，向瓶底注进D-Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉。（6）用吸管汲取培养液轻轻重复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；首次传代将原代细胞按1：1传代，此后按1：3进行传代。（7）传代后细胞放置在37℃，5%CO2孵育箱内造就。

　　还请莫吝笔墨哦呵呵，只是想偷偷懒了：）

　　4：我在做细胞培养时的一些小经验：

　　a：在超净台操作（废液杠放入）前要用紫外灯照30MIN以上，75%酒精擦手

　　b：贴块法要细胞贴壁好必定剪的够碎（先把血管剪成小段再狂剪一顿），展开时要均匀的展开，聚在一起翻面时轻易冲掉。

　　c：做原代的时候从取材直到放进孵箱都要严厉无菌操作，该换的管子还是换了，别省了根管子坏了一瓶细胞

　　d：原代培养FBS含量Zui好高些，原代很娇贵的

　　我现在培养的细胞是人绒毛膜癌细胞株JAR。Zui初，用0.25%胰酶消化液传代，细胞脱壁容易，但是，吹打细胞180次左右，也只有80％细胞是单个细胞，而且，易引起细胞机械性损伤。于是，我改良办法。现在，我的处置如下：弃旧培养液－－0.02％EDTA作用2分钟－－弃EDTA－－0.1％胰酶作用30秒－－弃胰酶，持续消化2分钟－－加培养液终止消化。一般吹打细胞30－40次，细胞根本为单个。

　　EDTA是一种化学螯合剂，重要作用主任已说。我要提示一下：EDTA作用不受血清克制，故消化后需彻底肃清，否则影响细胞生长。建议可能的话离心一下

　　我来说一下小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代，RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特征就是贴壁特殊牢，普通的方式基本就不可能将它消化下来，这也是养这种细胞Zui头痛的问题。现将我的一点心得，简介如下：

　　消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，试验前加温到37度

　　以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，弃往培养液，加D-HANKS 漂洗 两次；2. 加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基础圆形回缩即中断消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按须要分入 新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁 。

　　我来谈谈我养过的SK-BR-3（乳腺腺癌细胞系）的传代方式：刚开端养SK-BR-3时，细胞状态不是很好，贴壁也不均匀，于是开端想措施，斟酌是不是奏乐的不够，或是传得过多，或是其它的什么，后来发明的确如此，细胞的生长状况与传代的办法有很亲密的接洽。

　　我的传代方式是：

　　以50平方厘米造就瓶为例，待细胞长满瓶底70％－80％

　　1 吸除或倒掉瓶内旧培养基。

　　2 PBS 5ml加入培养瓶，轻轻晃动培养瓶，让PBS流遍细胞表面，倒掉。

　　3 PBS 5ml加入培养瓶反复洗一次，倒掉。

　　4 加进1ml胰蛋白酶消化液，轻轻动摇培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后置37度5％的二氧化碳造就箱放置5分钟，在显微镜下察看，发明细胞脱壁、变圆即可。

　　5 加入含血清的培养基5ml中断消化，汲取瓶内培养液，重复轻轻吹打瓶壁细胞，确保所有的瓶底都要吹打到。

　　6 吸1/3至1/4的细胞悬液接种至新的培养瓶，然后加8ml的新的细胞培养基，置37度5％的二氧化碳培养箱完成传代。

　　我来说说wish细胞的传代。wish细胞是上皮细胞， 人羊膜 细胞 ，培养基我用的是Zui常见的1640（10％小牛血清，加双抗）。

　　1细胞长满培养瓶时既要传代。我用胰酶和edta的混杂液消化。用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。edta的终浓度是0.02%。

　　2使用前37度预热，每个25ml培养瓶加9滴的胰酶和edta混杂液，消化液的量可依据自己培养瓶的大小而定，原则就是能够盖满瓶底。加入胰酶和edta混杂液以后，为使酶的活性Zui大，将培养瓶盖拧紧后放回培养箱中，5分钟左右即用含血清的培养基终止消化。如果在室温情形下消化，时间相应加长，可以用手给培养瓶加温，是消化液施展Zui大的作用。可以在显微镜下视察，当细胞界线已十分明白，从梭形变圆，即已分别为单个细胞，且有少量细胞漂起，则要终止消化了。

　　3将消化液倒掉，用eagle液洗涤一次。然后倒掉。

　　4加少量1640，用吸管轻轻奏乐。

　　5吸1/3至1/4的细胞悬液接种至新的培养瓶，然后加8ml的新的细胞培养基，置37度5％的二氧化碳培养箱完成传代。

　　说一下SACC（腺样囊性癌细胞）的传代。SACC比拟难消化，应用37度预热过的0.25%的胰酶一般消化5－8分钟即可，在看到细胞成片脱落伍参加10％胎牛血清的培育液终止。巴氏吸管吹打均匀，计数后传代。消化时一般不用EDTA，老板说对细胞损伤大，而且还要清洗几次，麻烦。只要消化下来，SACC很轻易形成单细胞悬液。

　　（缩略图，点击图片链接看原图）

　　说说昆虫细胞Sf9细胞(一种昆虫表达体系的宿主细胞)：

　　Sf9细胞生长条件：27℃、无需CO2、既可悬浮生长也可贴壁生长、培养基SF-900Ⅱ（无血清）。悬浮培养时把细胞在悬浮培养瓶中，要有转动装置（若无上述装置可把培养瓶放在小摇床上<200rpm摇振陪养）。贴壁培养时可把细胞在悬浮培养瓶中直接静置30-60分钟即可贴壁，传代时不用消化，用吸管轻轻吹打即可使细胞脱落下来，一般三天传一次代。

　　就我个人经验，悬浮培养更便利，细胞生长状态也不错。尤其对刚复苏的细胞Zui好先进行悬浮培养。待细胞长满或须要细胞时，用吸管把细胞吸入离心管中，1000转离心5分钟，然后弃掉上清，用手指将离心管中的细胞弹打均匀，加新培养基，吹打均匀即可分到另外一瓶中。本来瓶中可再加新培养基持续摇振陪养。

　　如需交换：hugeyao_999@163.com

　　我也来谈谈我养过的细胞消化的经验,我养过的贴壁细胞和半贴壁细胞有A549（肺腺癌细胞株,贴壁型）,NIH3T3(小鼠成纤维细胞,贴壁型),Ana-1(小鼠巨噬细胞,半贴壁型,普通的吹打可吹不下多数贴在壁的细胞哟).我应用的消化液为0.25%胰酶（不加EDTA），消化前同前面大多数同仁一样，37度温浴一下消化液和培养基，酒精棉球插试后拿进超净台。消化时先尽量将旧的培养液到尽，然后加一点胰酶消化液（量2-3mL）中和残存的细胞液，轻轻晃动几下使四周壁上残存的培养液都被消化液冲洗下来，到掉，再加入新颖的胰酶消化液，没细致胞即可，往返轻轻晃动，你会发现很快就能看清培养瓶细胞面有密布的针尖大小的点（凭你肉眼就能看到，那就是细胞，当然一点并不是一个细胞，不知大家平时注意过没有？），你不用拿到显微镜下察看，也不用估量时光，待轻轻晃动就能冲下细胞培养瓶上的上面讲到的针尖大小的点时，马上再加入完整培养液终止消化（量是消化液的2-3倍即可，大约3-4mL），轻轻吹打一两下即可转移到离心管离心，奥林巴斯显微镜，弃上清,加入新颖的完整培养液制成悬液，按你的请求分到其它的细胞培养瓶中即可。

　　此进程均未分开超净台，也不用加PBS等冲洗，大大减少了污染的机遇，而且操作也简略，我养细胞还从未失过手（从未污染过以及因消化传代细胞活气不佳），不过要视力好哟。

　　我来说说组织块无血清条件培养小鼠的颅神经嵴细胞：

　　将小鼠颅段神经管组织块（第6体节前）经0.75mg/ml胶原酶（152U/mg）换液消化3次，37℃20分钟孵育后，轻吹打获神经管，胶原酶通过冷培养基重复置换。将神经管组织块置于经Fn预孵的75MM培养瓶中（0.25mg/ml纤粘连蛋白抽干后，以条件培养基洗涤备用），37℃培养30分钟后组织块贴壁，加DMEM/F12无血清条件培养基。48小时后去除组织块。2.5g／L胰蛋白酶惯例消化传代。

　　无血清条件培养基的配方，在DMEM／F12无血清培养基中加入ITS (100mg／m1转铁蛋白、5mg／m1胰岛素、30nmoL/L亚硒酸)、孕酮(20nmoL/L)、腐胺(16mg／m1)、地塞米松(39pg／ml)、油酸甘油酯(10ng／m1)、牛血清白蛋白(1mg／ml)、生物素(1mg／mI)、甘油(3.6mg／m1)、表皮生长因子(100ng／m1)、成纤维细胞生长因子(0.4ng／m1)

　　弥补解释： 我做的试验是雌二醇对腺样囊性癌细胞的增殖作用，所以要消除雌二醇（E2）对试验的干扰。按产品阐明书配制无酚红RPMI－1640培养基。为肃清胎牛血清中的E2,按0.005g/ml剂量加入活性炭，37℃水浴2小时，过滤去除活性炭，56℃恒温水浴箱灭活，然后配制含10％（V/V）胎牛血清的RPMI1640培养液。SACC（腺样囊性癌细胞）致于37℃体积分数为5％二氧化碳孵箱内培养。

　　请高手先容一下小鼠前胃癌细胞MFC的培养及传代的经验和所需注意的处所。不胜感谢！！！

　　我来谈谈HFF（小儿包皮细胞）的传代:

　　弃培养液-->以无钙镁PBS液洗两次（用酚红做指导剂）使到达Zui佳消化PH值-->0.25％胰酶1-2ml（用酚红做唆使剂）消化( T75 瓶)-->到掉胰酶-->放入37度培养箱-->5分钟左右后镜下视察细胞回缩变圆-->轻轻拍打下来->以完全培液（DMEM+10% FBS）终止反映->吹打成单个细胞，然后以1:2-1:3传代。


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