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　　一、目标请求

　　1、学习控制细菌制片的操作技巧和无菌操作技巧。

　　2、学习控制细菌芽孢、鞭毛、荚膜的染色办法。

　　二、试验原理

　　细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基础技巧。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易辨认，必须对它们进行染色。应用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成显明的色差，从而能更明白地观察到其形态和构造。

　　染色前必需固定细菌。其目标有二：一是杀逝世细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增添其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种办法。固定时尽量保持细胞原有的形态。

　　1. 鞭毛是细菌的活动“器官，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛者生的位里和数目是细茵的一项主要形态特点。细菌的椒毛很纤细，其直径通常为0 . 01～0.02 um ，所以，除了很少数能形成毛束（由很多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观寮细菌的鞭毛，必需用鞭毛染色法。

　　鞭毛染色的基础原理，是在染色前先用媒染剂处置，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。鞭毛染色方式很多，本试验先容鞭毛染色法和改进的Uifson 氏染色法，前一种办法更轻易控制，但染色剂配制后保留期较短。

　　2.细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，显微镜报价配件，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是依据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特色而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还须要加热，以增进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的色彩难以渗出，而菌领会脱色。然后用对照度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢浮现出不同的色彩，因而能更显明地烘托出芽胞，便于视察。

　　3. 荚膜是包抄在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物资，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易染色；而且可溶于水，易在用水冲刷时被除往。所以通常用烘托染色法染色（负染色法），使菌休和背景着色，而荚膜不着色，在菌体四周形成一透明圈。由于荚膜含水高，制片时通常不用热固定，以免变形影响察看。

　　三、实验器材

　　1、菌种：苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）斜面菌种。

　　2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、载玻片、盖玻片、试管、细玻棒、水浴锅。

　　3、牛肉膏蛋白胨培养基、鞭毛染色液、0.5％沙黄水溶液、绘图墨水、95％乙醇、石炭酸复红染液、5%孔雀绿溶液、0.5%番红色液、蒸馏水、双料瓶（香柏油和二甲苯）。

　　四、方法步骤

　　1. 细菌鞭毛染色步骤：

　　（l）菌种的筹备请求用活泼生长期菌种作鞭毛染色和活动性的观察。对于冰箱保留的菌种，通常要持续移种1－2 次，然后可选用下列方式接种造就作染色用菌种：a取新配制的养分琼脂斜面（表面较湿润、基部有冷凝水）接种，28 ～ 32 ℃ 培育10～14h ，取斜面和冷凝水交接处培养物作染色观察资料；b选取新制备的养分琼脂（含0.8～1 . 0 ％的琼脂）平板，用接种环将新颖菌种．点种于平板中心，28～32 ℃ 造就18 ～30h ，让菌种扩散生长，取菌落边沿的菌苔（不要取菌落中心的菌谷）作染色视察的菌种资料。

　　（2）载玻片的筹备将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20 min ，取出用净水充足洗净，沥干水后置95％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。

　　（3）菌液的制备。取斜面或平板菌种培育物数环于盛有1－2 环无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片, 也可用培育物直接制片，但后果往往不如先制备菌液。挑菌时，尽可能不带造就基。

　　（4）制片取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，便菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸往玻片下端过剩菌液，室温｛或37 ℃ 温室）自然千燥。干后应尽快染色不宜放，时光过长。

　　（5）染色涂片干燥后，滴加鞭毛染色A 液顶盖3~5 min ，用熏馏水充分洗去A 液．用B 液冲去残水后，再加B 液夜盖涂片染色约数秒至l min ，当涂面呈现显明褐色时，立即用蒸馏水冲洗，若加B 液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗，自然干燥。

　　（6）镜检干后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的必定部位观察到鞭毛．

　　菌体呈深褐色，鞭毛显褐色、通常呈波浪形。

　　2. 细菌芽孢染色步骤：

　　A.改进的Schaeffer-Fulton氏染色法

　　（l）制备菌悬液：加1-2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。

　　（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充足混杂。

　　（3）加热：将此试管浸于沸水浴的烧杯中，加热15-20min。

　　（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于干净的载玻片上，做成涂面，晾干。

　　（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰3次固定。

　　（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿色彩为止。

　　（7）复染：加番红染液染色2-3min后，倾往染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。

　　（8）镜检：先低倍，再高倍，Zui后用油镜观察。

　　成果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。

　　B.Schaeffer-Fulton氏染色法

　　（l）涂片：按惯例方式将待检细菌制成涂片。

　　（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2-3次固定。

　　（3）染色：加数滴5%孔雀绿染液于涂片处，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染液冒蒸汽并开端盘算时光，保持5min。加热进程中要随时添加染色液，切勿让标本干枯。待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲刷，直至流出的水无色为止。用番红染液复染2min。

　　（4）水洗：用缓水流洗后，吸干。

　　（5）镜检：先低倍，再高倍，Zui后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。。

　　成果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。

　　3. 细菌荚膜染色步骤：

　　A. 干墨水法

　　（l） 制混杂液:加一滴6％葡萄塘液于干净载玻片的一端，然后挑取少量菌体与其很合，再加一环墨水，充足混匀．玻片必需干净无油迹．否侧，涂片时混杂液不能均匀散开

　　（2） 涂片:另取一端边沿光滑的载玻片作推片，将推片一真个边沿里于混合液前方，然后稍向后拉，当推片与混合液接触后，轻轻左右移动，使之沿推片接触的后缘散开，尔后以大约300o角敏捷将混合液推向玻片另一端，使混合液展成薄层.

　　（3） 干燥:空气中自然千燥．

　　（4） 固定:用甲醇浸没涂片固定一分钟．倾去甲醇．

　　（5） 干燥:在酒精灯上方用文火干燥．

　　（6） 染色:用甲基紫染1～2min

　　（7） 水洗:用自来水轻轻冲洗，自然干燥．

　　（8） 镜检:用低倍和高倍镜察看．

　　背景灰色．菌体紫色，菌体四周的清楚透明圈为荚膜．

　　B. Anthony 氏法

　　（1）涂片:按惯例取菌涂片。

　　（2）固定:空气中自然干燥。不可加热干燥固定。

　　（3）染色:用l％的结晶紫水溶液染色2 min．

　　（4）脱色:以20％的硫酸铜水溶液冲刷．用吸水纸吸干残液．

　　（5）镜检:干后用油镜视察．

　　菌体染成深紫色，菌体四周的荚膜呈淡紫色。

　　试验报告：

　　1． 绘出所用资料的芽胞、鞭毛、荚膜和菌体的形态图。

　　2．阐明芽胞染色法的原理。用简略染色法能否察看到细菌的芽孢？

　　3．用Schaeffer-Fulton氏染色法加热染色时，若因一时忽视玻片上的染液被烘干，此时是否立即补加染液？为什么？

　　4．若涂片上所观察到的只是大批游离芽孢，很少看到芽孢囊及养分细胞，你以为这是什么原因？


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