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　　 复方苦参注射液联合奥沙利铂对人肝癌

　　细胞株SMMC一7721增殖与凋亡的影响

　　210002 南京解放军八一医院全军肿瘤中心

　　华海清，姜子瑜，杨爱珍，秦叔逵

　　【摘要】 目标通过观察复方苦参注射液、奥沙利铂(OXA)及其两药联合对人肝癌细胞株SMMC一7721增殖与凋亡

　　的影响，探讨中药与化疗药物联合利用的协同增效作用。方式 采取MTY法视察复方苦参注射液、OXA及其两药联合对

　　SMMC一7721细胞增殖的影响；应用流式细胞术分析对细胞周期的影响；采用原位末端标志法(TUNEL)和荧光染色法观察对细

　　胞凋亡的作用。结果复方苦参注射液和OXA对SMMC-7721细胞均有显着的抑制增殖作用，该作用随着药物作用时间的延

　　长、剂量的增长而逐渐加强(P<0．01)；两药联合表现为相加或协同作用，与单药比较，有显着性差别(P<0．05)。TUNEL法

　　检测结果表明，复方苦参注射液(25 L／m1)、OXA(1 g／m1)以及两药联合作用于SMMC-7721细胞后均可诱导肝癌细胞凋亡，

　　凋亡指数(AI)分别为25．2％、16．2％和36．3％ ，联合组明显优于单药组(P<0．05)。流式细胞术剖析显示，复方苦参注射液、

　　OXA均可使细胞被阻滞于Go／G．期，两药联合较单药更为明显(P<0．05)。结论复方苦参注射液、OXA均能抑制人肝癌细

　　胞株SMMC-7721的增殖和引诱细胞凋亡，将细胞阻滞于G。／G．期，两药联合后作用增强，提醒复方苦参注射液和OXA联合应

　　用治疗肝癌可能会起到协同增效的作用。

　　【要害词】 复方苦参注射液； 奥沙利铂； 肝癌细胞； 细胞增殖； 细胞凋亡

　　中图分类号：R730．51；R735．7 文献标识码：A 文章编号：1009—0460(2010)01—0010—06

　　The efect of Fufangkushen injection alone and the combined efect with oxaliplatin for antiproliferative and

　　apoptotic action on human hepatoma cell line SMM C-7721

　　HUA Hai—qing，JIANG Zi—yu，YANG Ai-zhen，QIN Shu—kui．Center ofOncology，N锄 g 81 Hospital ofPLA，

　　ⅣⅡ ng 210002，China

　　【Abstract】 Objective By observing the efects of Fufangkushen injection and oxaliplatin alone and their combined effects for

　　cell proliferation and apoptosis on human hepatoma cell lines SMMC-7721 in vitro，the efect combination of chemotherapy with tradi—

　　tional medicine to cure hepatocarcinoma is investigated． M ethods MTr—test was used to estimate the inhibition of proliferation on

　　SMMC．772 1；flow cytometry Was applied to ana1) ze the distribution of cell cycle；fluorescence microscope and TUNEL method were

　　employed to observe the cell apoptosis．Results Fufangkushen injection and oxaliplatin could markedly inhibit the cell proliferation，

　　and the efect depended on exposure time and dose(P<0．01)；when they worked combinedly，the efect was additive and synergistic，

　　which had statistical significance comparing with Fufangkushen injection and oxaliplatin alone．TUNEL method showed that Fu—

　　fangkushen injection(25 m1)，oxaliplatin(1Ixg／m1)，as well as the two combined，could induce the apoptosis ofSMMC-7721；the

　　apoptosis index(AI)were 25．2％ ，16．2％ and 36．3％ respectively(P<0．05)，which were obvious that the combined group signifi—

　　cantly excelled the single work．Flow eytometry showed the proportion of ceHs increased at G0／Gl phase while it decreased at S phase，

　　indicating that drugs blocked cells at G0／G1 phase．The efect of pair work Was clearly superior to the single drug(P<0．05)．Con。

　　clusion Fufangkushen injection and oxaliplatin can inhibit the proliferation，induce the apoptosis of SMMC-7721 cell lines，and block

　　the cell cycle at G0／G1 phase．It is suggested that when those two drugs comb ined，a synergistic effect may be gotten for the treatment

　　of liver cancer on the liver cells．

　　【Key Words】Fufangkushen injection； Oxaliplatin； Human hepatoma cell； Proliferation of cells； Apoptosis of cells

　　基金项目：全军“十一?五”中医药临床重大攻关项目(2006051005)

　　志2010年1月第15卷第1期 lh； !se cl ! () ! 缸： Q ：!：

　　复方苦参注射液是由苦参、土茯苓为主的多味

　　中草药经现代技巧加工制成的现代中药制剂，具有

　　必定的抗肿瘤作用1-2。作为常用的化疗药物，奥

　　沙利铂(OXA)对消化体系肿瘤有较好的疗效。为

　　了探讨复方苦参注射液与OXA联合利用对原发性

　　肝癌是否具有协同增效作用，我们以人肝癌细胞株

　　SMMC 7721为研究对象，察看了两药单用及联合对

　　该细胞株增殖与凋亡的影响，现将结果报告如下。

　　1 资料与方式

　　1．1 资料

　　1．1．1 细胞株人肝癌细胞株SMMC一7721购自中

　　国科学院上海细胞生物研究所。

　　1．1．2 重要药品与试剂复方苦参注射液(简称：

　　复方苦参)：山西振东金晶药业有限公司；注射用

　　OXA：南京制药厂；噻唑蓝(Mrr)：Sigma公司；

　　Roche原位细胞凋亡检测(TUNEL)试剂盒：北京中

　　杉生物技巧有限公司；优级新生小牛血清：杭州四季

　　青生物工程公司；EDTA液：0．02％ ；盐酸异丙醇：

　　0．04mol／L，麦克奥迪；RPMI—l640培育基：Gibco公司；吖啶橙

　　(AO)／溴乙啶(EB)染液．：用PBS(pH7．2)配制AO／

　　EB各为lOO~g／ml的混杂溶液，4~C避光保留。

　　1．2 实验办法

　　1．2．1 MTF法观察复方苦参和OXA对SMMC一

　　7721细胞增殖的影响 取对数生长期SMMC一7721

　　细胞，消化制成单细胞悬液后，以3 X 10 ／ml浓度接

　　种于96孔板内，100~L／：fL，其中1个孔留作空白，在

　　37~C、5％CO 饱和湿度条件下的培养箱中造就24h。

　　取96孔板，参加配制好的不同浓度梯度的复方苦参

　　和OXA，使得复方苦参每孑L终浓度分别为6．25、

　　l2．5、25、50、100txL／ml，OXA每孑L终浓度分别为

　　0．125、0．25、0．5、1、2 g／ml，阴性对照组每孔参加

　　100pJ普通造就液，空缺孔加200tzl普通培育液(不

　　加细胞)，每个浓度组设3个复孔。置37~c、5％co，

　　饱和湿度条件下的造就箱中培养24、48、72h后弃上

　　清，每孑L加进1mg／ml M1Tr 1001xl，持续温育4h后吸

　　弃上清，参加盐酸异丙醇1001xl，振荡10rain后，用

　　主动酶标读数仪，在波长570nm处测定各孑L光接收

　　值(A)，取3个复孑L的平均值。以时间为横轴，A值

　　为纵轴绘制细胞生长曲线，并计算药物作用24、48、

　　72h后的增殖抑制率。

　　抑制率=[1一(实验组均匀A值一空缺孑L平均

　　A值)／(阴性对比组均匀A值一空缺孑L均匀A

　　值)j×100％。

　　依据计算得出各组的Ic 。值，选择适合的复方

　　苦参、OXA的浓度，将两药物联合，反复M1Tr法，绘

　　制细胞增殖曲线，盘算24、48、72h后的细胞增殖抑

　　制率。根据Weeb系数 来判定联合应用后的药物

　　作用，判定两药是否具有联合增效作用，采用以下公

　　式计算：预估效应C=A×B，其中A、B分辨指两种

　　药物作用后的细胞存活率。当实际存活率<C时，

　　联合处置即表现出协同作用；当实际存活率=C时

　　联合处置即表示出相加作用；当C<实际存活率<A

　　和B时，联合处理即表现出次加作用。

　　1．2．2 流式细胞术分析药物对SMMC-772 l细胞周

　　期的影响 将制备好的细胞标天职组后根据MTI"

　　实验结果选择的剂量加进复方苦参、OXA单药以及

　　两药联合，于37℃ 、5％CO，饱和湿度条件下培育

　　48h。0．25％胰蛋白酶消化后，收集细胞离心1000r／

　　rain×10min，弃上清液，将离心出的细胞PBS洗涤2

　　次，1000 r／min X 10min离心后，吸尽上清液，用

　　200lxl结合缓冲液悬浮细胞，分~JOJH入10 l Annex—

　　in—V—FITC和5 l PI混匀，避光4oC反映30min，再加

　　进3001~1联合缓冲液，立即于流式细胞仪检测。

　　1．2．3 原位末端标志法(TUNEL)观察各组SMMC一

　　7721细胞凋亡情形 将制备好的细胞标本依据

　　MTF实验结果选择的剂量加药，实验组分辨加复方

　　苦参、OXA单药以及两药联合，阴性对照组加等量

　　PBS液，培养48h后捞片。两药联合运用甲苯透明

　　处理，按解释书经TUNEL法染色后，苏木素轻度复

　　染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明树胶封片，镜检。光

　　镜下观察，凋亡细胞的细胞核呈黄褐色。10 X 10低

　　倍镜下随机选取5个细胞均匀散布的视野，10 X 20

　　中倍镜下每个视野随机选50个细胞计数凋亡细胞

　　数目和总的细胞数目，盘算凋亡指数(AI)。AI：凋

　　亡细胞数／总细胞数×100％。

　　1．2．4 荧光显微镜视察各组SMMC一7721细胞形态

　　变更将制备好的细胞标本依据MTT实验结果选

　　择的剂量加药，阴性对照组加等量普通培养液，于

　　37~C、5％CO 条件下持续培养48h。0．25％胰蛋白

　　酶消化后，收集上清细胞及贴壁细胞，细胞离心后将

　　离心出的细胞加2001xl培养液，81xl AO／EB染液，制

　　成细胞悬液，取一滴于载玻片上，盖以盖玻片，在荧

　　光显微镜下观察300个细胞，分离计数活细胞

　　(VN)、早期凋亡细胞(VA)、晚期凋亡细胞(NVA)

　　和逝世细胞(NVM)数，依照下列公式盘算凋亡率。

　　? l2? 20l0年1月第15卷第1期Chinese Clinical

　　凋亡率=(VA+NVA)／(VA+NVA+NVM+

　　VN)x100％

　　1．3 统计学分析应用SPSS 15．0对数据进行统计

　　剖析，两样本均数比较采取成组t检验，计数材料比

　　较采取 检验。以P<0．05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2．1 复方苦参、OXA及其两药联合对SMMC-7721

　　细胞增殖的影响

　　2．1．1 复方苦参、OXA对SMMC-7721细胞的抑制

　　作用MrlT法检测结果表明，复方苦参和OXA对

　　SMMC-7721细胞均有显着的抑制细胞增殖的作用

　　(P<0．01)，该作用具有时光、剂量依附性，即随着

　　药物作用时光的延伸、剂量的增添，对细胞的克制作

　　用逐渐加强。根据中效方程式计算复方苦参48、

　　72h对SMMC-7721细胞的Ic50值分离为38Ixl／ml、

　　2l l／／Illl；OXA 48、72h对SMMC-7721细胞的IC50值

　　分辨为0．65 g／ml、0．43Ixg／ml。见表1。

　　表1 复方苦参、OXA作用于SMMC-7721细胞的抑制率(％)

　　注：不同浓度各组之间比较，’P<O．O1；不同时间各组之间比较， P<0．01

　　2．1．2 复方苦参联合OXA对SMMC-7721细胞的

　　抑制作用根据药物对SMMC-7721细胞Ic∞值的

　　结果，选择浓度为50IxL／ml的复方苦参与1 g／ml的

　　OXA联合作用于SMMC-7721细胞，计算24、48、72h

　　的抑制率，结果表明：(1)复方苦参和OXA联合组

　　与两单药组的作用比拟，克制率有显明进步(P<

　　0．05)；(2)复方苦参和OXA联合作用24h和72h

　　后，细胞的存活率分离为52．80％和6．43％，高于预

　　计值48．87％ 和5．87％，表现为相加作用，但作用

　　48h后细胞存活率为18．14％ ，低于预计值

　　19．66％ ，表示为协同作用。见表2、图1。

　　表2 复方苦参和OXA联合作用于SMMC-7721细胞的抑制率(％)

　　注：与单用复方苦参或OXA比较， P<O．05

　　2．2 流式细胞术观察药物作用48h后SMMC-7721

　　细胞周期的变更 SMMC-7721细胞经复方苦参

　　50~l／ml、OXA1Ixg／ml和两药联合作用48h后，用流

　　式细胞仪进行细胞周期分析，结果显示，复方苦参和

　　OXA均可使G。／G。期细胞比例升高，s期细胞比例

　　降落，细胞被阻滞于G。／G。期；当两药联合后作用较

　　复方苦参和OXA单药更为明显(P<0．05)。见表

　　3、图2。

　　2010年1月第l5卷第1期Chinese ClinieM Oneology，Jan．2010，Vol ．

　　斟

　　器

　　量

　　逐一复方苦参+OXA

　　24 48

　　时光(h)

　　图1 复方苦参和OXA作用于SMMC-7721细胞

　　的时效曲线

　　表3 药物作用48h后细胞周期散布(％)

　　注：与对照组比拟， P<0．05； P<0．01；与复方苦参组比较， P

　　<0．Ol；与OXA组比拟，’P<0．05

　　2．3 TUNEL法观察药物作用48h后对SMMC．7721

　　细胞凋亡的影响 选择复方苦参25 l／ml、OXA

　　1 g／ml单药以及两药联合作用于SMMC-7721细

　　胞，48h后用TUNEL法检测细胞核的染色情形。光

　　镜下视察凋亡细胞的细胞核呈塌陷固缩，被染上深

　　褐色(图3)。在阳性对照组，经过脱氧核糖核酸酶

　　I(DNase I)处置后，染色体DNA双链断裂较充

　　分，视野中细胞核几乎全体染成深褐色。而在阴性

　　对比组，几乎没有细胞核被染上深褐色，因此在苏木

　　精复染时被染上了淡紫色。在药物组中，由于非特

　　异性吸附，也有较多细胞被染上褐色，但是细心鉴

　　别，只有凋亡的细胞核不但染成深褐色，而且色彩浓

　　重，体积较小，符合凋亡时细胞核固缩的特点。计算

　　凋亡指数(AI)后显示，复方苦参和OXA单药均能

　　引起细胞凋亡，且当两药联合后凋亡率显着增长。

　　见表4。

　　表4 药物作用48h后细胞凋亡指数(％ )

　　复方苦参(25~ m1)

　　OXA(1 m1)

　　复方苦参(25 ／m1)+OXA(1 g／m1)

　　注：与复方苦参组比较，’P<0．05；与OXA组比较， P(0．01

　　? 13 ?

　　2．4 荧光显微镜观察药物作用后SMMC-7721细胞

　　形态的变更 选择复方苦参50~l／ml、OXA1 g／ml

　　以及两药联合作用于SMMC-7721细胞。经AO／EB

　　染色后，活细胞(VN)核染色质着绿色呈正常构造，

　　早期凋亡细胞(VA)核染色质着绿色呈固缩状或碎

　　裂状，晚期凋亡细胞(NVA)核染色质着橘红色呈固

　　缩状或碎裂状，逝世细胞(NVM)核染色质着橘红色呈

　　正常构造(图4)。成果显示，复方苦参和OXA单药

　　均可引起细胞凋亡，两药联合后凋亡率明显增添。

　　见表5。

　　表5 药物作用48h后细胞凋亡率

　　注：与对照组比较， P<0，01；与复方苦参组、OXA组比较， P

　　<0．05

　　3 讨论

　　药物治疗是失往局部治疗指征的中晚期肝癌的

　　重要治疗手腕，化疗可以起到迁就性的治疗作用，但

　　疗效欠佳，一般以为有效力在15％ 以下，目前尚无

　　证据证实能够延伸患者生存。中医药是中晚期肝癌

　　治疗的常用办法之一，大批的临床和实验表明，中药

　　治疗肝癌副作用小，有助于稳固瘤体，提高患者的生

　　活质量，并有可能延伸生存。如何将化疗与中医药

　　治疗有机联合起来，以取长补短，上风互补，从而提

　　高肝癌综合治疗后果，一直是临床探讨的主要课题。

　　OXA是第三代水溶性铂类化合物，其化学名为

　　左旋反式二氨环己烷草酸铂，其抗癌作用与顺铂

　　(PDD)和卡铂(CBP)类似，以DNA为靶作用部位，

　　铂原子与DNA链上G共价联合，形成链内交链、链

　　间交链及蛋白质交链，使DNA损伤，损坏DNA复

　　制，造成肿瘤细胞逝世亡。试验研讨显示，必定浓度的

　　OXA可以抑制原发性肝癌细胞株HepG2的体外增

　　殖，引诱其产生凋亡 J。临床研讨表明，以OXA为

　　主的FOLFOX计划化疗对于国人原发性肝癌疗效

　　较好，安全性较高，不良反映较轻，耐受性好 』，一

　　项FOLFOX方案与阿霉素进行随机对照的Ⅲ期临

　　， 。． 石5． 4． 3 L2 J O 。

　　苤胜擅生苤圭呈Q! Q 生! 旦筮! ! 鲞筮! 翅垡堕璺! 看垦!型! ：皇! Q坚! !! 碰：』! ! ： 兰Q! Q! ! ! !： ! ! ：型

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　　C h a n n e l s 『P E — A 1

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　　4 0 8 0 1 2 0 16 0 2 0 0

　　C h a n n e l s rP E — A 1

　　对照；B ：O X A ( 1 Ix g ／m 1) ；C ：复方苦参( 5 0 1a ． 1／n d ) ；D ：复方苦参( 5 0 1~ l／m 1 ) + O X A ( 1 “g

　　图2 药物作用4 8 h 后S M M C ． 7 7 2 1 细胞周期散布情形

　　粪一三二≤}≤I。喜‘；" 6-三≤

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　　C h a r m e l s fP E — A 1

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　　～：阳性对照；B ：阴性对比；c ：复方苦参( 2 5 斗∥ m 】) ；D ：O X A ( 1 g g ／m 1 ) ；E ：复方苦参( 2 5 肛】／m J ) + O X A ( 1 雌

　　图3 T U N E L 法检测药物作用4 8 h 对S M M C ． 7 7 2 1 细胞凋亡的影响( × 2 0 0 )

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　　I ：复方{

　　2 ：0 X A (

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　　5 0 “l／m 1) ， A ：活细胞；B ：早期凋亡细胞；C ：死细胞

　　m 1 ) ， A ：晚期凋亡细胞；B ：死细胞

　　5 0 1x l ／m 1 ) + O X A ( 1 斗g／m 1 ) ， A ：晚期凋亡细胞；B ：死细胞

　　图4 荧光显微镜观察药物作用S M M C ． 7 7 2 2 1 细胞形态的变化( A O／E B × 2 0 0 )

　　床研究结果尚待揭晓。复方苦参含有苦参碱、氧化

　　苦参碱、槐定碱等多种活性成分.

　　。已有研究发

　　现，苦参碱可以抑制肺癌A 5 4 9 细胞和肝癌S M M C 一

　　7 7 2 1 细胞的增殖和转移， 诱导细胞凋亡。引

　　。有报道

　　复方苦参对肺腺癌细胞( L A C ) 、L e w i s 肺癌和肝癌

　　H e p 、H 2 2 细胞增殖均有克制作用一j

　　；对S G C - 7 9 0 1 、

　　H e p G 2 和B e l - 7 4 0 2 细胞株亦有显明的抑制造用，可

　　将H e p G 2 和S G C 一7 9 0 1 细胞的周期阻滞于G ：期，诱

　　导细胞凋亡㈨’

　　。复方苦参与OX A 联合对抑制肝癌

　　细胞的增殖、引诱凋亡是否会起到协同增效作用目

　　一x Jc 一^K】∞0 (一口0 0 t ，一】(1N c

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　　2010年1月第15卷第1期 Chinese Clinical Oncology，Jan．2010，Vo1．15

　　前尚未见相干报道，因此我们选择将这两种药物联

　　合作用于SMMC7721细胞，观察其相互影响。

　　本试验通过MrITr法发明复方苦参对肝癌

　　SMMC-7721细胞株的增殖有显着的抑制造用。从

　　时效曲线可以看出，随着复方苦参浓度的增添和作

　　用时间的延长，对SMMC-7721细胞的抑制率逐渐上

　　升，阐明它的抑制造用具有必定的剂量和时间依附

　　性；同样OXA的作用亦具有剂量、时间依附性。根

　　据MTY实验的成果，参照各药的Ic 。的浓度，我们

　　选择了浓度为50ixt／ml的复方苦参与1 g／ml的

　　OXA联合作用于SMMC一7721细胞，成果表明，当

　　50ixl／ml的复方苦参和1 g／ml的OXA结合作用

　　24h和72h时，其抑制增殖的后果较单药作用时大

　　大加强，表示为相加作用；作用48h时表现为协同作

　　用，阐明复方苦参对OXA具有协同增效作用。

　　细胞凋亡与肿瘤的产生、发展、消退等存在着密

　　切的接洽。肝癌的敏捷生长是癌细胞增殖与凋亡调

　　控失衡的结果。诱导肝癌细胞凋亡是肝癌治疗的重

　　要方式之一。本实验通过TUNEL法和荧光染色法

　　察看了复方苦参和OXA单药及其两药结合对肝癌

　　细胞凋亡的影响，结果表明，复方苦参和OXA单药

　　均能诱导SMMC．772 l细胞凋亡，二者联合运用时细

　　胞凋亡率显明进步，与单药相比，具有统计学意义

　　(P<0．05)。流式细胞术剖析发明，复方苦参和

　　OXA对SMMC．7721细胞的周期均发生了阻滞作

　　用，使SMMC一7721细胞G。／G，期比例增高，而S期

　　细胞比例降落；当两药联合后，这种作用得到了明显

　　增强，阐明复方苦参联合OXA抗肝癌的作用是通过

　　将SMMC一7721细胞周期阻滞在G。／G．期，从而阻断

　　细胞的生长和决裂而实现的。

　　综上所述，复方苦参与OXA联合利用对肝癌

　　? l5 ?

　　SMMC7721细胞有良好的协同增效作用，表明中药

　　与化疗药物联合运用能进步肝癌疗效。这一研究结

　　果既为临床中药与化疗结合治疗肝癌供给了试验依

　　据，亦为肝癌治疗供给了一个有价值的联合治疗方

　　案，值得我们进一步研讨与探讨。

　　参考文献

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　　收稿日期：2009—10—10； 修回Ft期：2009—1I一08


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