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　　【摘要】 【目标】 研究经Triton X-100 脱细胞处理的牛颈静脉的组织结构和生物力学特性以及作为组织工程血管支架的可能性。【方法】 获取10条新鲜带瓣牛颈静脉，随机分为两组，新鲜对比组(n = 5)和脱细胞实验组(n = 5)，脱细胞组血管使用2.5 mL/L Triton X-100等进行脱细胞处理48 h， 病理切片染色和扫描电镜观察血管壁和瓣膜自身细胞的脱除情况和细胞外基质变化情况;生物力学性能检测血管组织强度变化;体外人内皮种子细胞种植以懂得脱细胞支架的生物相容性。【结果】 脱细胞处理后，管壁和瓣膜的自身细胞完全脱除而弹力纤维和胶原纤维无明显改变;与新鲜牛颈静脉相比，脱细胞血管的拉伸强度[(16.5 ± 2.61)MPa vs (15.5 ± 3.1)MPa; P > 0.05]和Zui大持线力[(7.9 ± 0.9)N vs (7.0 ± 1.1)N; P > 0.05]无明显改变，在100 mm Hg液压下脱细胞血管无异常扩张;内皮种子细胞在脱细胞血管支架上生长黏附良好。【结论】 Triton X-100法对新鲜牛颈静脉进行脱细胞处理后果良好，脱细胞牛颈静脉可作为细胞种植的血管支架使用。

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　　【要害词】 牛颈静脉;脱细胞支架;组织工程;细胞种植

　　Bovine Jugular Vein Decellularized with Triton X-100 as a Potential Scaffold for Vascular Tissue Engineering

　　LU Jun， ZHANG Jing-fang， CHEN Xin-xin， HUANG Wei

　　(Department of Cardiovascular Surgery， Research Center of Medical Sciences， Guangdong Provincial People's Hospital， Guangzhou 510080， China)

　　Abstract： 【Objective】To study the composition and strength of bovine jugular vein decellularized with Triton X-100 and to determine its potential as a vascular tissue-engineering scaffold. 【Methods】 Fresh bovine jugular veins (n = 10) were obtained and divided into two groups (n = 5) at random， the fresh group and the decellularized group， specimens in decellularized group were treated with 2.5 mL/L Triton X-100 and sodium-deoxycholate for 48 h. Residual cells and extracellular matrix composition were studied with light and electron microscopy. The strength of graft was measured in vitro by insufflation and pull-through techniques. Decellularized specimens were seeded with human endothelial cells and cultured for 7 d. 【Results】 2.5 mL/L Triton X-100 together with sodium-deoxycholate completely removed native bovine cells. Collagen morphology and elastin staining appeared unchanged. Compared with fresh bovine jugular vein， decellularized vein had similar in vitro tensile stress [(16.5 ± 2.6)MPa vs (15.5 ± 3.1)MPa; P > 0.05] and suture-holding strength [(7.9 ± 0.9)N vs (7.0 ± 1.1)N; P > 0.05]， and had no abnormal dilation under 100 mm Hg intraluminal pressure. Endothelial cells attached to acellular specimens and grew well. 【Conclusion】 Bovine jugular vein rendered acellular with Triton X-100 presented an excellent scaffold for recellularization with human cells.

　　Key words：bovine jugular vein; decellularized scaffold; tissue engineering; seeding

　　带瓣牛颈静脉作为移植管道资料近年来逐渐引起国内、外学者器重[1，2]。戊二醛固定处理的牛颈静脉带瓣管道已逐渐商品化并开端利用于临床显微镜。但随着临床运用病例数的增多和随访时光的延伸，戊二醛固定处理的带瓣牛颈静脉的毛病逐渐显露，例如：宿主的内皮细胞无法迁移生长;轻易涌现血栓、狭小和炎性反映;另外，牛颈静脉自身固有细胞残留还能诱发宿主移植免疫排挤反响，终极导致管道钙化和衰败[4-6]。

　　Zui近的国内、外研究发明脱细胞的自然血管支架的细胞外基质完整，可增进细胞黏附、生长，而且理化特性与自然血管类似[7-10]，但关于牛颈静脉脱细胞处理的研究鲜见报道。国内吕卫东等[11]曾报道结合使用5 mL/L Triton X-100 和0.25 g/L 胰蛋白酶等对新鲜牛颈静脉进行脱细胞处理72 h，固然管壁细胞完整往除但血管组织稳固性明显降落。因此联合国内外研究经验，本研究采用2.5 mL/L Triton X-100和2.5 g/L 脱氧胆酸钠等对新鲜带瓣牛颈静脉进行脱细胞处理48 h，制备血管基质支架，并在此基本上进行细胞种植，懂得脱细胞牛颈静脉的生物力学特性和组织相容性变化情形，为进一步动物体内试验供给理论基本。

　　1 资料和办法

　　1.1 新鲜带瓣牛颈静脉获取

　　从当地菜牛屠宰厂获取新鲜带瓣牛颈静脉，尽量干净条件下取出，浸泡在0 ℃～ 4 ℃磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS，Gibco，USA)中运回，2 h内在无菌条件下剥除血管外膜，挑选管壁完全、内附1～ 2组瓣膜、长度8 cm的血管10条，应用PBS液重复冲刷5遍，保留在含有抗生素的4℃ PBS液中(青霉素100 kU/L，链霉素0.1 g/L， Gibco， USA)。

　　1.2 血管脱细胞处置

　　10条牛颈静脉分两组，脱细胞试验组和新鲜对比组，每组5根血管，分辨放进50 mL无菌离心管(Corning， USA)中，脱细胞实验组：离心管内参加含2.5 mL/L Triton X-100(Sigma， USA)、2.5 g/L脱氧胆酸钠(Amresco， USA)、0.2 g/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，Gibco， USA)、0.1 g/L核糖核酸酶( ribonuclease， RNase， Sigma) 和0.2 g/L脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuc-lease，DNase，Sigma)的PBS液40 mL，脱细胞处置48 h，24 h换液1次;新颖对比组：牛颈静脉仅应用PBS液浸泡，24 h换液1次。脱细胞进程在37 ℃恒温摇床(SCS-24 Shaker， 上海市离心机械研讨所)中连续振荡(200 r/min)完成。

　　1.3 病理组织学检讨

　　脱细胞进程完成后留取两组血管的部分管壁和瓣膜使用100 mL/L福尔马林固定，石蜡包埋后切片，苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin， HE染色)，光学显微镜下视察牛颈静脉自身细胞残留情况。细胞外基质中的胶原和弹力纤维散布排列情况则使用Verhoff-vonGieson染色(VG染色)结合Masson染色显示。

　　1.4 扫描电镜

　　两组血管的部分管壁和瓣膜用25 mL/L 戊二醛固定，逐步脱水，置换，临界点干燥，喷金，扫描电镜(Quanta 400，FEI company， Holland)视察管壁和瓣膜细胞脱落和纤维排列情况。

　　1.5 生物力学性能检测

　　将两组血管壁纵向裁剪成0.5 cm × 2 cm大小血管条，使用万能电子拉力机(Instron5566，USA)测量两组血管条(n = 10)的纵向拉伸强度(tensile stress)。将4-0 聚丙烯滑线(prolene， Ethicon Inc， USA)缝于同样大小的血管条边沿，边距约2 mm，同样使用万能电子拉力机测量两组血管条(n = 10) 纵向Zui大持线力(suture-holding strength)。两组完整血管截取4 cm长行注水试验，近端插管，灌注充斥PBS液，远端阻断钳封闭，使用冠状动脉球囊扩大测压装置(ACS Indeflator，USA)和压力换能装置衔接心电监护仪，测量100 mm Hg压力下两组血管(n = 5)的直径变化，同时视察有无渗漏情况。

　　1.6 血管支架细胞种植实验

　　将脱细胞牛颈静脉纵向剪开，PBS液重复冲刷3遍，使用特制的圆形刀具将牛颈静脉壁裁剪成12个直径1 cm的血管圆片，管腔面向上放进24孔细胞培养板(Corning，USA)中，每孔参加1 mL 含100 mL/L胎牛血清(fetal calf serum，FCS，四季青公司，杭州)的DMEM/F-12细胞造就液(Gibco， USA)并放入37 ℃细胞造就箱中预衬24 h，然后吸去预衬液，将自人骨髓间充质干细胞引诱分化而来的内皮细胞[12]使用DMEM/F-12培育液消化奏乐成密度为7× 108个/L的细胞悬液，在放有血管圆片的12孔中每孔参加0.5 mL细胞悬液，调剂终极种植全造就液为1 mL含100 mL/L FCS 、100 kU/L青霉素、0.1 g/L链霉素的DMEM/F-12培育液，放进37 ℃、50 mL/L CO2、相对饱和湿度的培育箱中培养7 d，每两天换液1次。第7天取血管片固定，行惯例HE染色和扫描电镜检讨，察看种植细胞在血管片表面的生长情况。

　　1.7 统计学方式

　　采用SPSS11.0统计软件包处理数据。所得数据采用均数±尺度差表现，采取t检验作统计剖析，P < 0.05具有统计学意义。

　　2 成果

　　2.1 大体肉眼察看

　　脱细胞后的牛颈静脉泛白，管壁和瓣膜完整，内膜光滑，质地与新鲜牛颈静脉相比无明显变化。

　　2.2 牛颈静脉脱细胞情况

　　病理染色和扫描电镜显示，牛颈静脉管壁全层和瓣膜上自身细胞基础完整脱除， 未见明显细胞残留(图1)，组织构造紧凑， 无明显水肿，显微镜报价支架报价。扫描电镜可见管腔面和瓣膜表面的内皮细胞脱除后其深层纤维组织袒露(图2)。

　　2.3 脱细胞后牛颈静脉胶原纤维和弹力纤维变更

　　光学显微镜下察看，新鲜牛颈静脉管壁细胞外基质重要由胶原和弹力纤维构成，约占50% ～ 60%以上，瓣膜细胞外基质重要由胶原纤维组成，约占90%以上，弹力纤维极少。脱细胞前后管壁的胶原纤维无显着变化，弹力纤维构造完全，瓣膜胶原纤维排列稍疏松，但无明显断裂。

　　2.4 生物力学性能测试成果

　　注水前两组血管直径(n = 5)无显着差别[新鲜组(9.5 ± 0.4)mm vs 脱细胞组：(9.3 ± 0.4)mm; t = 0.669，P = 0.54];在管腔内液压为100 mm Hg时，两组血管膨胀，但均未呈现渗漏情形，脱细胞血管与新鲜血管相比[新颖组：(20.2 ± 2.1)mm vs 脱细胞组：(21.7 ± 2.2)mm;t = 1.108，P = 0.33]直径变化无明显性差别，并没有涌现异常扩大(表1)。血管壁的拉伸强度[(16.5 ± 2.6)MPa vs(15.5 ± 3.1)MPa; t = 0.558，P = 0.59]和Zui大持线力[(7.9 ± 0.9)N vs(7.0 ± 1.1)N;t = 1.35，P = 0.21]在脱细胞前后无显明变化。

　　2.5 血管支架细胞种植实验

　　光学支架(图3)和扫描电镜(图4)显示内皮种子细胞在脱细胞血管支架表面生长良好，浮现展路石状，形成一层持续生长的单细胞层，细胞间呈现纤维衔接。

　　3 讨论

　　3.1 脱细胞方式的选择

　　有多种方法可以使血管组织脱细胞，目前常用的脱细胞方法主要是酶消化法和除垢剂洗涤法。不同的脱细胞方法在支架细胞消除率、种子细胞黏附率及保持血管支架的生物力学特性等方面存在不同。Triton X-100 是一种非离子型表面活性剂，可以通过其分子上的亲水基团溶解细胞而到达扫除血管壁细胞成分的目标。Samouillan等[13]研究发现使用Triton X-100 和胆盐处理瓣膜组织并不影响胶原和弹力纤维的结构稳固性。Kasimir等[14]研究也发明不同浓度的Triton X-100(2.5 mL/L和 5 mL/L)都可以完全肃清猪自动脉管壁和瓣膜的内皮细胞，细胞外基质结构可以完全保存，但胰蛋白酶脱细胞法却可以严重损坏血管支架的基质结构。吕卫东等[11]使用Triton X-100 和胰蛋白酶相联合的方法对牛颈静脉进行脱细胞处理，也发明往细胞处理后牛颈静脉的组织稳固性明显降落。本试验前期研究曾经使用过两种脱细胞方法， 一种方法是单独使用0.5 g/L胰蛋白酶对新鲜牛颈静脉脱细胞处理24 h、48 h和72 h;另一种方法是结合使用0. 5 g/L胰蛋白酶和2.5 mL/L Triton X-100分辨处理24 h，病理切片和扫描电镜检讨发现这两种脱细胞方法固然可使管壁和瓣膜表面的内皮细胞完整脱除，胶原纤维改变稍微，但管壁和瓣膜深层仍有大批牛自身细胞残留，而且弹力纤维损坏严重，管壁和瓣膜组织疏松。斟酌到胰蛋白酶对组织结构的侵害，再联合国内外文献材料[10，15-17]和自身前期实验结果，本研究摒弃胰蛋白酶，而采取2.5 mL/L Triton X-100 + 2.5 g/L脱氧胆酸钠 + 0.2 g/L EDTA + RNase + DNase的脱细胞办法，实验结果显示脱细胞后果满足而且血管支架的生物力学特征等无明显改变。

　　3.2 细胞外基质的保留

　　胶原纤维主要起到保持血管组织自身强度的作用，其中Ⅳ型胶原纤维更有利于内皮细胞的黏附和生长，弹力纤维则负责血管的舒张和压缩，因此这两种纤维结构完整对于进一步的内皮种子细胞种植和组织工程血管的构建极其主要。Triton X-100法即能将新鲜牛颈静脉自身固有细胞完全肃清又能较好保持细胞外基质结构完整，为内皮种子细胞种植供给了良好的脱细胞血管基质支架。

　　3.3 脱细胞血管生物力学特征的变更

　　恰当的初始管壁强度对于构建心外移植管道来说非常主要，假如移植管道组织构造疏松，不仅不利于手术缝合，而且会涌现漏血或管道扩大，甚至敏捷呈现瘤状转变。本研讨结果表明经过Triton X-100等处置48 h后牛颈静脉管壁强度并没有产生显明转变，这一成果也与胶原纤维和弹力纤维的形态学变更相一致。本试验之所以采取100 mm Hg液压丈量有关数据，是由于脱细胞牛颈静脉重要作为重建右心室流出道的移植管道，而右心体系压力较低，所以100 mm Hg液压基础可以反应脱细胞牛颈静脉是否合适作为组织工程血管支架。由于牛颈静脉自身瓣膜窄小、微薄，惯例力学丈量仪器无法对其相干组织强度数据进行丈量，故本试验仅能依据其胶原和弹力纤维的情形推测其力学性能无显着改变，进一步关于管壁和瓣膜的生物力学性能研讨将通过动物在体实验来完成。

　　3.4 脱细胞血管的生物相容性

　　内皮种子细胞在脱细胞牛颈静脉的管腔面生长黏附良好，表明经过Triton X-100等处理的脱细胞牛颈静脉生物相容性良好，Triton X-100等无残留毒性，合适内皮种子细胞种植。

　　综上所述，本研究以为：2.5 mL/L Triton X-100等对新颖牛颈静脉进行脱细胞处理的方式切实有效;应用上述办法获得的脱细胞牛颈静脉的力学特征无显明转变而且能够进行细胞种植，这为下一步体外动态细胞种植和动物体内试验供给了理论根据。

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