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常用细胞凋亡检测方式(上)

https://www.optical17.com 来源:原创 日期:2011-8-8 9:04:55
  【资源】常用细胞凋亡检测方式

  在试验中经常须要检测细胞的凋亡情形,下面我收集了一些常用的细胞凋亡检测方法,盼望对大家有辅助!>一、细胞凋亡的形态学检测1 光学显微镜和颠倒显微镜  (1) 未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完全但呈现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞呈现皱缩、变圆、脱落。  (2) 染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边沿化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典范的凋亡形态。  2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜  一般以细胞核染色质的形态学转变为指标来评判细胞凋亡的进展情形。  常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌进式的,重要联合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。  Hoechst是与DNA特异联合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,应用时用PBS稀释,终浓度为10 ug/ml。  DAPI为半通透性,用于惯例固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为10 ug/ml。  成果评判:细胞凋亡进程中细胞核染色质的形态学转变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质涌现浓缩状况;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝集、边沿化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,发生凋亡小体(图1)。  3 透射电子显微镜视察  结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,涌现很多称为气穴现象(cavitations)的空泡构造(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝集、边沿化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=593 height=595 title="Click to view full 1.jpg (593 X 595)" border=0 align=absmiddle>图2--- (缩略图,点击图片链接看原图)二、磷脂酰丝氨酸外翻剖析(Annexin V法)   磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,裸露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依附性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标志了的Annexin-V作为荧光探针,应用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的产生。  碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完全的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和逝世细胞,PI能够透细致胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配应用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及逝世细胞区离开来。  办法   1 悬浮细胞的染色:将正常培育和引诱凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次,参加100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10ul,室温避光30min,再加进PI(50ug/ml)5ul,避光反响5min后,参加400ul Binding Buffer,立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1h), 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对比。  2 贴壁造就的细胞染色:先用0.25%的胰酶消化,洗涤、染色和分析同悬浮细胞。  3 爬片细胞染色:同上,Zui后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行察看。  成果 [图4、图5]  注意事项   1. 全部操作动作要尽量柔柔,勿用力奏乐细胞。  2. 操作时注意避光,反映完毕后尽快在一小时内检测。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=387 height=235 title="Click to view full 3.jpg (387 X 235)" border=0 align=absmiddle>图4-- (缩略图,点击图片链接看原图)图5-- screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=616 height=647 title="Click to view full 5.jpg (616 X 647)" border=0 align=absmiddle>三、线粒体膜势能的检测   线粒体在细胞凋亡的进程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可引诱不同的细胞产生凋亡,而线粒体跨膜电位DYmt的降落,被以为是细胞凋亡级联反映进程中Zui早产生的事件,它发生在细胞核凋亡特点(染色质浓缩、DNA断裂)呈现之前,一旦线粒体DYmt瓦解,则细胞凋亡不可逆转。  线粒体跨膜电位的存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质,其荧光的加强或削弱阐明线粒体内膜电负性的增高或下降。  方式:将正常培育的细胞和引诱凋亡的细胞参加应用终浓度为Rhodamine 123(1mM)或终浓度为DiOC6(25nM),JC-1(1mM),TMRM(100nM),37°C平衡30min,流式细胞计检测细胞的荧光强度。  注意事项  1. 始终坚持平衡染液中pH值的一致性,由于pH值的变更将影响膜电位。  2. 与染料到达平衡的细胞悬液中假如含有蛋白,他们将与部分染料结合,下降染料的浓度,引起假往极化。四、DN *** 断化检测   细胞凋亡时重要的生化特点是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的衔接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片断, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表示为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处置后,采取惯例办法分别提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可视察到典范的DNA ladder。假如细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标志,然落后行电泳和放射自显影,察看凋亡细胞中DNA ladder的形成。  1. 大分子染色体DN *** 段的测定细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片断。所有超过必定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度雷同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时,即到达辨别力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA,DNA像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为"爬行"。因此,细胞凋亡早期发生的50~300kbp长的DNA大片断不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分别。通常采取脉冲电泳技巧可美满地解决这一问题。这个方式是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向转变后,大的DNA分子便滞流在爬行管中,直至新的电场轴向重新定向后,才干持续向前移动。DNA分子量越大,这种重排所须要的时光就越长。当DNA分子变换方向的时光小于电脉冲周期时,DNA就可以按其分子量大小离开。  参考文献 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039  2. DNA Ladder 测定  方法:收获细胞(1′107)沉淀?细胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA(5mg/ml)56°C,2h?蛋白酶K(2.5mg/ml)37°C,2h?1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA,4°C过夜?14000rpm′15min?Zui后将沉淀溶解在TE buffer中,加DNA Loading Buffer?1.2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色并照相。  成果:[图6]  参考文献 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507  3. 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计剖析  方法:收集细胞?70%冷乙醇(in PBS)4°C固定过夜?PBS洗涤,1000rpm′10min?RNase A(0.5mg/ml)37°C消化30min?PI(50mg/ml)染色,室温避光15min?FACScan剖析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变更。  结果:[图8]  4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)长处:敏感度高,合适于检测少量样本,小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=442 height=368 title="Click to view full 6.jpg (442 X 368)" border=0 align=absmiddle>图8-- screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=262 title="Click to view full 7.jpg (917 X 376)" border=0 align=absmiddle>

  五 TUNEL法   细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而发生大批的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标志到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相联合的研讨办法,对完全的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能正确地反映细胞凋亡典范的生物化学和形态特点,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培育的细胞和从组织中分别的细胞的细胞形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研讨中被普遍采取。


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