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　　一革兰染色的试验步骤

　　1.涂片：滴一小滴无菌水于载玻片中心，用接种环取平板或斜面培养物少许，与载玻片上的水滴混杂均匀，涂成一薄层。

　　2.干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之敏捷干燥，但勿靠近火焰。

　　3. 固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速往返移动3~4次，共约3~4秒。请求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。

　　4. 染色：（1）初染：结晶紫染液，奥林巴斯生物显微镜，1min ，水洗。（2）媒染：卢戈碘液，1min，水洗。 （3）脱色：95%乙醇，30s，转动玻片，水洗。（4）复染：稀释复红液，30s，水洗。 5.镜检：菌体呈紫色的为“革兰阳性菌”（G+菌）；菌体呈红色，为“革兰阴性菌”（G- 菌）。二.尿液标本的培养检讨

　　一、培养检查

　　1．一般细菌培养 用无菌接种环取尿液接种于血琼脂平板和麦康凯Macc(或中国蓝EMB)平板上，35℃培养18～24h，观察结果，依据菌落形态特点及涂片镜检结果，选择相应方式作进一步鉴定，如培养48h无菌生长，则可报告“无细菌生长”。

　　2．特别细菌培养

　　(1)淋病奈瑟菌培养：尿标本收到后立即接种于预温35℃的巧克力琼脂平板，置35℃5％～l0％C02环境中培养。

　　(2)结核分枝杆菌培养：将尿液接种于血琼脂平板上，35℃培养18～24h后无细菌生长，可将尿液3 000r/min离心30min后取沉淀物0.1ml接种在罗氏培养基上。

　　(3)假丝酵母菌培养：将尿液接种沙保弱琼脂平板上，25～30℃培养。

　　(4)厌氧菌培养：用穿刺尿进行培养，接种厌氧血琼脂平板，厌氧环境中培养。

　　二、定量培养

　　1．平板接种法 用定量加样器取5ul尿液滴注在琼脂平板上，用接种环涂抹均匀，35℃培养24h，生长的菌落数乘200，即为每毫升尿中细菌数。

　　2．定量接种环法 用定量接种环蘸取尿液标本(10p1)在血琼脂平板上作均匀划线接种，置35℃培养24h，计数生长的菌落数乘以100，即为每毫升尿

　　三.平板划线分别法

　　　　在被检标本中，常混淆有多种细菌，平板划线分离法可使这多种细菌在培养基表面疏散生长，各自形成菌落，以便依据菌落的形态及特点，挑选单个菌落进行纯培养。常用的平板划线分离法有以下两种：

　　　　1.持续划线分离法：此法重要用于杂菌未几的标本。用接种环取标本少许，于平板1/5处密集涂布，然后往返作曲线持续划线接种，

　　线与线间有必定间隔，划满平板为止。

　　　　2.分区划线分别法：本法实用于杂菌量较多的标本。先将标本均匀涂布于平板表面边沿一小区（第一区）内，约占平板1/5面积，再在二、三、……区依次持续划线。每划完一个区，均将接种环灭菌一次。每一区的划线均接触上一区的接种线1、2次，使菌量逐渐减少，

　　以获得单个菌落。

　　3、划线完毕，盖上平皿盖，底面向上，用标签或腊笔注明菌名检验号码，接种者信息等，置37℃孵育造就24小时后察看成果。

　　四.细菌检验标本处置操作规程

　　1．目标

　　规范细菌检验标本处置操作规程。

　　2．实用范畴

　　细菌检验标本。

　　3．职责

　　细菌检验职员严厉履行本程序。

　　4．程序

　　（1）血液标本

　　吸收标本后，立即抄写检验记录单，住院病人需先收取细菌培养鉴定费用。门诊病人在检验记录单上记录住址、联系电话等信息。将血细菌培养瓶置于全主动培养仪中培养。

　　（2）痰标本

　　接受时检查送检标实质量，随后缮写检验记录单，住院病人需先收取细菌培养鉴定用度。门诊病人在检验记录单上记录住址、接洽电话等信息。

　　用接种环挑取脓性痰液后在第一区重复涂抹，尽量将包裹在痰中的病原菌接种在平板上，如无法用接种环挑取痰液时，用无菌棉签挑取标本分辨涂布于血琼脂平板、巧克力琼脂平板，麦康凯平板的第一区，然后用接种环划第二、第三区。

　　同时做痰涂片镜检，将成果记载在检验记载单上。

　　（3）咽拭子标本：吸收时检查送检标本质量，随后抄写检验记录单，住院病人需先收取细菌培养鉴定费用。门诊病人在检验记录单上记录住址、联系电话等信息。将标本涂布于血琼脂平板、巧克力琼脂平板，麦康凯平板的第一区，然后用接种环划第二、第三区。

　　（4） 脑脊液、关节液、心包穿刺液、胸腹水等穿刺液：床边抽取体液标本（成人瓶：5～8ml；小儿瓶：1～3ml）注进细菌培养瓶后送试验室。吸收标本后，立即抄写检验记录单，住院病人需先收取细菌培养鉴定费用。门诊病人在检验记录单上记录住址、联系电话等信息。将血细菌培养瓶置于全主动培养仪中培养。

　　（5） 粪便或肛拭标本：接受时检讨送检标实质量，随后缮写检验记录单，住院病人需先收取细菌培养鉴定用度。门诊病人在检验记载单上记载住址、接洽电话等信息。立即取粪便脓血部位标本依据检验申请请求选择平板接种。一般细菌培养时接种血琼脂平板、麦康凯平板和SS平板。

　　（6 ）尿标本：接受时检讨送检标实质量，随后

　　五.显微镜的应用与维护

　　1．将显微镜置于安稳的试验台上，镜座距实验台边缘约为4cm，坐正。

　　2．调节光源：将低倍物镜转到工作地位，把光圈完整打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源，光线较强的自然光源宜用平面镜，光线较弱的自然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。视察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。

　　3. 低倍镜观察染色装片

　　首先降落镜台，将酵母菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察地位移至低倍镜正下方，镜台升至距装片0.5cm处，恰当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使镜台降低至发明物像时，改用细调节器调节到物像明白为止。移动装片，把适合的观察部位移至视野中心。

　　4. 高倍镜察看染色装片

　　眼睛分开目镜从侧面观察，旋转物镜转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。再由目镜观察，细心调节光圈，使光线的明亮度合适。用细调节器校订焦距使物镜清楚为止。将Zui合适观察部位移至视野中心。不要移动装片地位，筹备用油镜观察。

　　5. 油镜观察染色装片

　　提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油；从侧面凝视，警惕慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩展为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，破坏镜头；

　　将光线调亮，从目镜观察，用粗调节器将镜台渐渐降落(切忌反方向旋转)，当视野中有物像呈现时，再用细调节器校订焦距。如末找到物像，必需再从侧面视察，将油镜降下，反复操作直至物像看清为止。细心视察并绘图；再次观察提起镜筒，换上细菌三型染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。反复观察时可比第一次少加香柏油。

　　6. 镜检完毕后的工作

　　降落镜台，取出装片；干净油镜，油镜应用完毕后，须用擦镜纸擦往镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许擦镜液擦掉残留的香柏油，Zui后再用清洁的擦镜纸擦干残留的擦镜液；擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。Zui后套上镜罩，对号放进镜箱中，置阴凉干燥处寄存。

　　缮写检验记录单，住院病人需先收取细菌培养

　　六.斜面接种法

　　此法重要用于鉴定或保留菌种，或察看细菌的某些生化特征和动力。具体操作如下：

　　（1）用左手握住菌种管和斜面培育基底部，右手持接种环或接种针。

　　（2）用右手小指与手掌、小指与无名指分辨拔出两管的棉塞，将管口通过分焰灭菌。

　　（3）用接种环或接种针伸入菌种管内，挑取用来移种的菌落。

　　（4）伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线，或直接自下而上地蜿蜒划线。

　　（5）接种完成之后，用火焰灭菌培养管口，并塞上棉塞，置于37℃培养。

　　鉴定用度。门诊病人在检验记载单上记载住址、接洽电话等信息。将尿标本混匀，用10μl（可用定量加液器）定量接种环立即接种血琼脂平板、麦康凯平板、TM巧克力平板，分别细菌和菌落计数。

　　中细菌数，若平板上菌落数超过l 000个，则报告：菌落数>105CFU/ml。

　　3．倾泻平板法取被检尿液0.1ml，参加9.9ml无菌生理盐水中充足混匀，取此液lml放进直径为9cm的无菌平皿内，同时参加已熔化并冷却至50℃的琼脂培育基与尿

　　液混匀，凝固后置35℃培养24h，计数生长菌落乘l00即为每毫升的菌落数。

　　七.液体造就基接种法

　　1.取菌：用灭菌接种环挑取菌落或标本。

　　2.接种：用左手握住液体培养基试管底部，将细菌在试管内壁与液面接壤处轻轻研磨，使细菌均匀得散落在液体培养基中。

　　八.微生物检验技巧基础操作项目

　　一、油镜应用和维护

　　二、细菌不染色标本检查法

　　三、革兰氏染色法

　　四、抗酸染色法

　　五、细菌造就基的制备

　　六、细菌的接种

　　七、细菌的培育

　　八、细菌的生化反映实验

　　九、药物敏感实验

　　3. 培养：接种完毕，置37℃孵育培养24小时后观察成果。


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