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　　 中度嗜热浸矿微生物的富集、培养及驯化

　　中南大学资源加工与生物工程学院 曾伟民

　　1.1 引言

　　目前生物湿法冶金范畴中常用的浸矿菌种为氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）、氧化硫硫杆菌（Acidithiobacilus thiooxidans）和氧化亚铁钩端螺旋菌（Leptospirillum ferrooxidans），它们的合适生长温度为 28℃-40℃，这些中温菌已在金、铜、锌、铀等的生物提取上获得了必定的运用。然而这些中温浸矿微生物对庞杂浸矿环境（重金属含量高、存在有毒砷离子、高温等）的适应性有限，如矿物氧化放热导致浸出槽和浸矿堆中经常发生较高的温度，采用中温菌浸出速度慢、浸出率低，而且对某些难溶矿如黄铜矿等不能连续浸出，使得生物浸矿的产业利用并不广泛。

　　20世纪90年代，人们开始器重高温菌浸矿的研讨和运用。这些高温菌包含中度嗜热菌，Zui佳生长温度45℃-60℃，重要有Sufobacillus菌属；极度嗜热菌，Zui佳生长温度60℃-85℃，重要有Sulfolobus和Sulfolobus like archaea等。研讨表明，高温条件下（50℃-80℃）高温菌不仅可以明显地提高浸出反应动力学，加快反应速度，缩短浸出周期；而且可以防止黄铜矿等部分原生硫化矿的过度钝化阻碍浸出反应的进行，Zui终极大地提高浸出速率和浸出率。而其中的中度嗜热菌较极度嗜热菌能耐受更高的金属离子浓度和矿浆浓度，因此在生物冶金利用中具有更大的潜力。本章旨在收集中国多个铜矿山矿坑水和矿泥样品，采用多种培养基（以硫和亚铁为能源物质）富集中度嗜热微生物并优化其生长条件，然后将扩大培养后的浸矿微生物进行对高金属离子浓度和高黄铜矿矿浆浓度的驯化实验。

　　1.2 资料与方式

　　1.2.1 浸矿菌种采集

　　中度嗜热浸矿微生物固然Zui佳生长温度在45℃-60℃之间，但是依然能在中温环境下与中温菌一起存在（28℃左右）。因此各种露天的铜硫化矿及煤矿的酸性矿坑水是适合且便利的样品采集点。

　　采集样品时，用pH试纸测试矿坑水的pH值，如pH在1.0-4.0之间，且水样色彩呈红棕色（Fe3+的色彩）或蓝色（Cu2+的色彩），则阐明该矿坑水中可能有浸矿微生物的存在。采集的水样不能太满，须留一定空间存空气，并争夺能在一个星期内运送到实验室进行富集和培养。

　　本实验所用的浸矿微生物采集于江西德兴铜矿，广东大宝山铜矿，安徽铜陵铜矿，广东玉水硫铜矿，湖南郴州煤矿等矿山的矿坑水中，在进行富集培养前，将上述所有矿坑水混合，然后采用多种培养基富集中度嗜热浸矿微生物。

　　1.2.2 菌种的富集造就

　　将混杂后的矿坑水采用改良后的9K培养基（(NH4)2SO4 3.0 g/L, Na2SO4 2.1 g/L, MgSO47H2O 0.5 g/L, K2HPO4 0.05 g/L, KCl 0.1 g/L 和Ca(NO3)2 0.01 g/L）进行中度嗜热浸矿微生物的富集。

　　取150mL的上述培养基于500mL的锥形瓶中，参加50mL混杂后的矿坑水，然后添加20 g/L的硫酸亚铁和5g/L的单质硫。初始pH值由1：1的硫酸调至pH 2.0。富集试验在45度的摇床中进行，摇床转速为 180 r/min。培养至第三天时，再次接种30mL的混合矿坑水，读数显微镜价格，培养至第七天时，再次接种20mL矿坑水。菌种培养进程中采取计数板在光学显微镜下察看微生物数目，当菌种数目达到107 个/mL时，进行传代造就。

　　传代培养的培养基同样为改良9K，培养温度45度，初始pH值为2.0，摇床转速为180 r/min。接种菌为上一次富集后的微生物，接种量为10%。经过2-3次的传代培养后，菌种数目达到108 个/mL，此时开始进行菌种生长条件优化实验。

　　1.2.3 菌种的生长条件优化试验

　　1.2.3.1 菌株Zui适生长温度的测定

　　将处于对数生长期的中度嗜热富集物按5%的接种量接种到改良9K培养基中(接种后菌体浓度为2.0×106个/mL -3.0×106个/mL)。分辨置于39℃、42℃、45℃、48℃、51℃和54℃，180 r/min转速下振荡培养，直至细菌进进稳定生长期。用血球计数板计数（下同），视察不同温度下中度嗜热富集物的生长情况。

　　1.2.3.2 菌株Zui适初始pH值的测定

　　用1：1硫酸调节培养基pH值，分辨为：0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2和3.4。接种5%处于对数生长期的中度嗜热富集物，置于48℃，180 r/min的摇床中振荡培养3天。测定初始pH值对该富集物生长的影响。

　　1.2.3.3 有机物对菌株生长的影响

　　在48℃，初始pH2.0的条件下，分辨添加三种不同浓度的酵母粉、蛋白胨和葡萄糖（0 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L和0.8 g/L）到造就基中，接种5%处于对数生长期的中度嗜热富集物，置于180 r/min的摇床中振荡培养6天。考核有机物对该富集物生长的影响。

　　1.2.4 菌种的扩展培养

　　菌种的扩展培养在一个3L的搅拌反应器中进行（图2.1），机械搅拌速度为500 r/m。反应器置于恒温槽中，以坚持浸矿温度（48度）的恒定。通过空气泵往反应器内泵进空气，速度为360mL/min。反应器内蒸发丧失的水分通过恒流泵持续流加蒸馏水来弥补。

　　参加1950mL的改进9K培养基，接种50mL中度嗜热富集物，添加30 g/L的硫酸亚铁和8g/L的单质硫作为能源物质。采用1：1的硫酸调节溶液的初始pH值至2.0。天天用计数板在光学显微镜 （Olympus CX31）下检测溶液中的菌种数目，天天用pH计(pH S-3C 酸度计)检测溶液pH值的变更情况。

　　1.2.5 中度嗜热富集物对高黄铜矿矿浆浓度的驯化

　　黄铜矿的驯化实验在搅拌反响器中进行。将处于对数生长期的中度嗜热富集物接种到改进9K培养基中，接种量为10％，另外参加10 g/L 的硫酸亚铁，3 g/L的单质硫和5 g/L的黄铜矿精矿（矿物成分及含量见表2.1）。用1：1的硫酸调节pH值为2.0，培养温度为48度。由于黄铜矿浸出初期耗酸比拟多，因此在培养初期采取1：1硫酸调节溶液pH值坚持在2.0，直至浸矿液中的产酸量高于耗酸量；在培养后期，当溶液pH值降至1.6左右，且培养液中菌体浓度超过108个/mL时，过滤除渣，收集浸出液，并进行第二次菌种驯化。

　　第二次驯化条件跟第一次相似，只是将能源物质中硫酸亚铁和单质硫的含量分离下降到3 g/L和1 g/L，但将黄铜矿的矿浆浓度提高到10 g/L。大概培养2周，当溶液中的菌种浓度超过108个/mL时，过滤除渣，收集浸出液，并进行第三次菌种驯化。

　　第三次驯化进程中不再添加亚铁和单质硫作为能源物质，仅以12 g/L的黄铜矿为能源物质。此次培养时间相对延伸至大约20天，当溶液中的菌种浓度超过108个/mL时，过滤除渣，收集浸出液并用做下次驯化的接种液。此后不断反复第三次驯化进程，直至中度嗜热富集物在只有黄铜矿（12 g/L）作为能源物质的条件下能在10天内达到Zui大菌种密度。

　　当中度嗜热富集物能在12 g/L的黄铜矿矿浆浓度下生长较好时，将该富集物接种于含16 g/L黄铜矿的矿浆中，然后反复上述步骤，依次接种于21 g/L 、28 g/L、 37 g/L 、50 g/L和80 g/L的黄铜矿矿浆中，直至该中度嗜热富集物能耐受80 g/L黄铜矿矿浆。并在8％矿浆浓度下，接种未驯化菌作为对比实验。在每个矿浆浓度下，当铜浸出率趋于稳固时，视为该浸出实验停止，并测定浸出液中Cu2＋和Pb2＋的浓度。Cu2＋和Pb2＋离子浓度通过 ICP-OES测定。

　　1.3 成果与讨论

　　1.3.1 中度嗜热微生物的富集培育及其生长参数优化

　　以亚铁和单质硫为能源物资，在摇瓶中采取改进9K培育基不断富集中度嗜热浸矿微生物，终极微生物的Zui大菌种浓度到达1.4×108 个/mL。通过光学显微镜察看，发明该富集物的菌种形态不一，有长杆状、螺旋状和椭球状等类型，应为多种微生物的混杂体。为了进一步优化该富集物的生长参数，我们研讨了不同生长温度，不同初始pH值，不同有机物种类和浓度下微生物的生长情形。

　　1.3.1.1 温度对中度嗜热富集物生长的影响

　　实验考察了中度嗜热富集物在初始pH值为2.0但不同温度下（35℃，39℃，45℃，48℃，51℃，54℃和60℃）的生长情况。生长温度为48℃时，培养6天后的微生物进入稳定生长期，菌种浓度达到约2.4×108个/mL； 45℃和51℃时，菌种浓度相对48℃时有必定水平的下降；39℃和54℃时，菌体浓度都在5 ×107个/mL以下，而且该菌进入生长稳定期的时光分离延迟到14天和10天，表明菌的生长受到很大克制；另外该富集物在60℃和35℃下均无生长。因此得出该中度嗜热富集物的Zui适生长温度为48℃。

　　1.3.1.2 初始pH值对中度嗜热富集物的生长影响

　　实验考核了中度嗜热富集物在生长温度为48℃但初始pH值不同的条件下的生长情况。如图2.2所示，当pH值为2.0时，中度嗜热微生物的菌种浓度约为2.4×107个/mL，浮现Zui佳生长状况；当pH值高于3.0时，该菌基础上无生长，甚至逝世亡，表明相对较高的pH值会克制该菌的生长；当pH值低于1.4时，该菌仍具有必定的生长活性，菌体浓度为0.6－2.8×107个/mL，表明其嗜酸性较强。文献报道：生物浸出黄铜矿末期，由于浸出液中Fe3+的还原和S0的氧化，发生大批的酸，导致溶液终极的浸出液pH值能降到1.3左右，此时只有嗜酸性强的微生物才干存活下来。由此可见，该中度嗜热富集物的高度嗜酸性为其有效浸出黄铜矿供给了可能。

　　1.3.1.3 有机物对中度嗜热富集物生长的影响

　　实验考核了在生长温度为48℃，初始pH值为2.0的条件下，添加不同浓度的酵母粉、蛋白胨和葡萄糖后中度嗜热富集物的生长情况。成果表明：加入葡萄糖后不久，微生物的生长受到克制，随着葡萄糖浓度的升高，细菌生长量不断减少，甚至逝世亡；但是酵母粉和蛋白胨的加入能较大水平提高该菌的生长量，当添加0.4 g/L的酵母粉和蛋白胨时，细菌菌体浓度分离达到了3.6×107个/mL 和4.1×108个/mL。因此，添加适量的含氮有机物如酵母粉和蛋白胨，有利于中度嗜热微生物的生长。

　　1.3.1.4 中度嗜热富集物的生长曲线

　　综合以上优化后的生长参数，在pH值为2.0，温度为48℃条件下，添加0.4 g/L的蛋白胨，20 g/L除菌的FeSO4和5 g/L除菌的单质硫，接种5%处于稳固生长期的中度嗜热富集物，置于180 r/min 转速下振荡培养，察看微生物的生长情形。

　　优化生长参数后的中度嗜热富集物的生长曲线如图2.4。成果表明：接种后的2天内，该菌处于适应阶段，菌体浓度低于5×107个/mL。从第3天开端，微生物的生长开端加速，并于第四天进入指数增加期，到第7天时，中度嗜热富集物进进稳定生长期，此时菌种浓度接近Zui大，约为4.3×108个/mL。稳定期的时光较短，只延续到第11天，之后培养液中微生物数目不断减少。

　　通过生长参数优化后的中度嗜热微生物，在7天内能达到Zui大菌种浓度（4.3×108个/mL），相对没有进行参数优化（45 ℃，初始pH2.0）的菌体浓度（2.4×108个/mL），有了较大的提高。

　　1.3.2 中度嗜热富集物对高黄铜矿矿浆浓度的驯化 当中度嗜热富集物从摇瓶中接种到搅拌反映器中进行扩展培育时，微生物的生长速度相对摇瓶中有了较大的进步，这是由于搅拌反响器能为微生物供给更充分的氧气和二氧化碳，并且使溶液的 匀质后果更好。以亚铁和单质硫为能源物质，该富集物在搅拌反映器中能在5天内到达Zui大菌种浓度，为7.8×108个/mL。但是当直接仅以黄铜矿为能源物质时，该富集物的生长速度非常迟缓，铜的浸出后果非常不幻想，因此必需进行中度嗜热微生物对黄铜矿的驯化。 通过不断减少溶液中的亚铁和硫两类能源物资，但迟缓增添黄铜矿的含量，中度嗜热富集物对黄铜矿的适应性不断加强。到Zui后溶液中仅以黄铜矿为能源物质时，中度嗜热微生物在20天内的菌种浓度接近8 ×107个/mL。这表明该富集物已经开端能浸出黄铜矿，并从中获得生长所需的能源物资如亚铁和硫。

　　为了进一步加强中度嗜热富集物对黄铜矿的耐受才能，本实验考核了该富集物在不断增添黄铜矿矿浆浓度后的生长情形和铜的浸出才能。图2.5 为驯化试验中中度嗜热微生物在不同矿浆浓度下的铜浸出率。随着矿浆浓度的增长，黄铜矿的浸出率有了较大的降落，但是铜浸出率到达稳固的时光却不断增添。

　　当黄铜矿矿浆浓度为10 g/L时，铜浸出率为94%，浸出时间仅为7天。然而当黄铜矿矿浆浓度增加到80 g/L时，铜浸出率下降到74%，浸出时间延伸至42天。

　　在搅拌反映器中，黄铜矿矿浆浓度的增长会增长反响体系的剪切力，从而严重影响微生物的生长。另外，在高矿浆浓度下，固然铜的浸出率相对较低，但铜离子和铁离子的浓度却比低矿浆浓度时高出很多，高浓度的金属离子同样不利于微生物的生长。尽管如此，相比没有驯化的中度嗜热富集物（80 g/L 矿浆浓度下铜浸出率仅为24%），驯化微生物对矿浆浓度的耐受性和浸出黄铜矿的能力都有了很大的进步。

　　1.4 小结

　　（1） 从中国多个铜矿山的矿坑水中胜利富集到一种中度嗜热混合物，并对其生长条件如温度，初始pH值，有机物应用等进行了优化，终极在以亚铁和单质硫为能源物质，改良9K无机盐为培养基，生长温度为48度，初始pH值为2.0，并添加0.4 g/L的蛋白胨后，该富集物在摇瓶中7天内能达到Zui大菌种浓度为4.3×108个/mL，在搅拌反应器中的5天内能达到Zui大菌种浓度为7.8×108个/mL。

　　（2） 经过中度嗜热富集物对黄铜矿的不断驯化，该富集物在80 g/L的黄铜矿矿浆浓度下生长良好， 42天内铜的浸出率为74%。相比未驯化菌而言（42天内铜浸出率仅为24%），驯化后的中度嗜热富集物对黄铜矿的浸出才能有了相当大的进步。


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