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　　实验五 细菌菌落视察及生化鉴定实验、微生物的染色技巧

　　实验项目性质：综合设计实验

　　所属课程名称：《水处置微生物学实验》

　　实验打算学时：4 学时

　　一、细菌菌落观察

　　1 实验目标

　　察看细菌的菌落形态。

　　2 试验原理

　　菌落形态是指某种微生物在必定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌在必定培

　　养条件下形成的菌落各具有某些相对的特点，应用察看这些特点，来区分各大类微生物及初

　　步辨认、鉴定微生物。

　　3 材料

　　实验四中已经分别培育的细菌。

　　4 内容

　　观察已知细菌菌落的形态、大小、色泽、透明度、致密度和边沿等特征。

　　5 成果

　　记载细菌的菌落特点。

　　二、细菌生化鉴定实验【以过氧化氢酶（接触酶）试验为例】

　　1 实验目的

　　控制细菌过氧化氢酶实验方式。

　　2 实验原理

　　具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢天生水和新生态氧，继而形成分子氧呈现气泡。

　　3 资料

　　3%过氧化氢溶液；实验四中已经分别培养的细菌菌落。

　　4 方式

　　取菌体置于干净的试管内或玻片上，然后加3%过氧化氢，立即观察结果。

　　5 成果

　　有大批气泡发生者为阳性。不产赌气泡者为阴性。

　　三、微生物染色技巧

　　（一）细菌的简单染色法

　　1 实验目的

　　1.1 学习微生物涂片、染色的基础技术。

　　1.2 控制细菌的简略染色法。

　　1.3 初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的应用办法和无菌操作技巧。

　　2 实验原理

　　细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基础技术。细菌的细胞小而透明，在普通的

　　光学显微镜下不易辨认，必需对它们进行染色。应用单一染料对细菌进行染色，使经染色后

　　的菌体与背景形成显明的色差，从而能更明白地视察到其形态和构造。此法操作简便，实用

　　于菌体一般外形和细菌排列的观察。

　　常用碱性染料进行简略染色，这是由于在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带

　　负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容

　　易与细菌联合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对照，在显微镜下更易于

　　辨认。常用作简略染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。

　　当细菌分解糖类产酸使培养基pH 降落时，细菌所带正电荷增添，此时可用伊红、酸性

　　复红或刚果红等酸性染料染色。

　　染色前必需固定细菌。其目标有二：一是杀逝世细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增添其

　　对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方式。固定时尽量保持细胞原有的形态。

　　3 资料

　　3.1 菌种

　　枯草芽孢杆菌12～18h 营养琼脂斜面造就物、金黄色葡萄球菌约24h 养分琼脂斜面培育

　　物、大肠杆菌24h 养分琼脂斜面造就物、面包酵母琼脂斜面培育物。试验教师可依据具体情

　　况供给适合的菌种。

　　3.2 染色剂

　　吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。

　　3.3 仪器或其他用具

　　显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，

　　生理盐水或蒸馏水等。

　　4 流程

　　涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。

　　5 步骤

　　5.1 涂片

　　取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸馏水)于玻片中

　　央，用接种环以无菌操作，分辨从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌

　　苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体造就物)涂片，可用接种环挑取2～3 环

　　直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。

　　5.2 干燥

　　室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太

　　近，因温度太高会损坏菌体形态。

　　5.3 固定

　　如用加热干燥，固定与干燥合为一步，办法同干燥。 涂片、干燥和热固定。

　　5.4 染色

　　将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2 滴于涂片上(染液恰好笼罩涂片薄膜为宜)。

　　吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min 。

　　5.5 水洗

　　倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲刷，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，

　　不要水流直接冲刷涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

　　5.6 干燥

　　甩往玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。

　　5.7 镜检

　　涂片干后镜检。涂片必需完整干燥后才干用油镜观察。

　　6 结果

　　绘制单染色后观察到的大肠杆菌和藤黄微球菌的形态图。

　　（二）革兰氏染色法

　　1 试验目标

　　1.1 懂得革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的主要性。

　　1.2 学习控制革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的应用办法。

　　2 实验原理

　　革兰氏染色法是1884 年由丹麦病理学家Christain Gram 氏创建的，革兰氏染色法可将

　　所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌

　　学中Zui主要的辨别染色法。

　　革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结

　　构和组成不同决议的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成

　　初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫联合成结晶紫-碘的复合物，从而加强了染

　　料与细菌的联合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色后果是不同的。革兰氏阳性细菌的

　　细胞壁重要由肽聚糖形成的网状构造组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细

　　胞壁脱水、使肽聚糖层的网状构造孔径缩小，透性下降，从而使结晶紫-碘的复合物不易被

　　洗脱而保存在细胞内，经脱色和复染后仍保存初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于

　　其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处置时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细

　　胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比拟轻易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上

　　复染剂的红色。

　　3 资料

　　3.1 菌种

　　大肠杆菌（ Escherichia coli ） 约24h 养分琼脂斜面菌种一支， 枯草芽孢杆菌

　　（Bacillus subtilis）约16h 牛肉膏琼脂斜面菌种一支。

　　3.2 染色剂

　　结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。

　　3.3 仪器或其他用具

　　显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。

　　4 流程

　　涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。

　　5 步骤

　　5.1 涂片

　　5.1.1 惯例涂片法

　　取一干净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏

　　水，以无菌接种环分辨挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要干净无油，否则菌液涂不开。

　　5.2 初染

　　滴加结晶紫(以恰好将菌膜笼罩为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色

　　液，细水冲刷至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。

　　5.3 媒染

　　用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。

　　5.4 脱色

　　用滤纸吸往玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，

　　直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。

　　革兰氏染色结果是否准确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的要害环节。脱色不足，阴性菌

　　被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时光一般约20～30s。

　　5.5 复染

　　在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的进程中，

　　不可使染液干枯。

　　5.6 镜检

　　干燥后，用油镜视察。断定两种菌体染色反映性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌

　　（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。

　　5.7 实验停止后处置

　　干净显微镜。先用擦镜纸擦往镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上

　　的残留油迹，Zui后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干。

　　四、实验结果

　　1. 记载细菌的菌落特征。

　　2. 记载待测细菌的过氧化氢酶试验结果。

　　3. 依据观察结果，绘出两种细菌的形态图。

　　4. 列表简述两株细菌的染色结果(菌的外形、色彩和革兰氏染色反映)。

　　五、思考题

　　1. 哪些环节会影响革兰氏染色成果的准确性？其中Zui要害的环节是什么？

　　2. 进行革兰氏染色时，为什么强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会呈现什么问题?

　　3. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴

　　性菌应分辨是什么色彩?

　　4. 不经过复染这一步，能否差别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？

　　5. 你以为制备细菌染色标本时，应当注意哪些环节?

　　6. 为什么请求制片完整干燥后才干用油镜察看?

　　7. 假如涂片未经热固定，将会呈现什么问题?加热温渡过高、时光太长，又会怎样呢?


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