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　　第十章

　　名词说明

　　1、电子显微镜应用电子波波是非，辨别力高的特色以电子流取代光学显微镜的光束使物体放大成象的超显微镜检装置。

　　2、普通光学显微镜用自然光或者灯光作光源镜检物体的显微镜。

　　3、合成培养基由化学成分已知的营养物质配制而成的培养基。

　　4、培养基人工配制的供微生物生长滋生并积聚代谢产物的一种营养基质。

　　5、自然培养基由化学成分不完整明白的自然物质如马铃薯,麸皮等配制而成的培养基。

　　6、半合成造就基由化学成分已知的化学物资和化学成分不完整明白的自然物资配制而成的培育基。

　　7、革兰氏染色法。革兰氏染色是细菌的一种辨别染色法，细菌首先用结晶紫染色，再用碘液固定，然后用95%的酒精脱色,Zui后用蕃红复染。凡是菌体初染的结晶紫被酒精脱往了紫色后，又被蕃红复染成红色的细菌称为革兰氏负反响细菌；凡是菌体初染的紫色不能被酒精脱色，也不能被蕃红复染成红色的细菌称为革兰氏正反映细菌。

　　8、简略染色用单一染料使微生物细胞染上所用染料色彩的染色方法。

　　9、稀释平板计数法将必定量的样品经十倍稀释后，用平板培养Zui后三个稀释度的样品稀释液。待菌落长出后，计数出某一稀释度的菌落数后再乘以稀释倍数，即为样品中的含菌数。

　　显微直接计数法应用血球计数板或细菌计数板在显微镜下测计出每小格的微生物细胞数目后，再换算出单位体积中微生物细胞总数的测数方式。

　　10、巴氏消毒巴氏消毒是法国微生物学家巴斯德发现的一种消毒方法。是在62-63℃的条件下，保温半小时杀死微生物的营养体(主要是病原菌)的方法。

　　11、间歇灭菌:应用100℃的温度杀逝世微生物的营养体.每次1小时持续三天，中间的空隙时光让未杀死的芽胞萌发成营养体，在下一次100℃的温度下被杀逝世。如此重复两次可将培养基的微生物(包含芽胞)全体杀死。该办法实用于没有高压灭菌器的处所进行灭菌处置。

　　12、消毒只杀死微生物的营养体(主要是病原菌)，而不能杀死微生物的芽胞的除菌方法。

　　13、灭菌利用物理或化学方法杀逝世所有微生物包含细菌的芽胞的除菌方法称为灭菌。

　　14、过滤除菌利用一定孔径的滤膜禁止微生物的通过而除往溶液中或者空气中微生物的除菌方法。

　　15、湿热灭菌利用热的蒸汽杀死微生物的灭菌方法。湿热灭菌又分常压蒸汽灭菌和加压蒸汽灭菌。

　　16、干热灭菌利用干热空气杀死微生物的方法。其灭菌工艺条件通常为160-170℃/2h。

　　17、选择培养基依据应用的目标，把持培养基的组成成分，使之有利于某种微生物的生长而限制其它微生物的生长，从而能从自然界混淆的群体中分离出某一种单一的微生物。如无氮培养基用来分离土壤中的自生固氮菌。

　　18、加富培养基在基础培养基中参加血清，动植物组织液或者其它生长因子而配制出来的养分特殊丰盛的培养基。

　　19、辨别培养基依据微生物的代谢特色，通过唆使剂的显色反映，用以辨别不同微生物的培养基。

　　20、数值孔径数值孔径是断定物镜和聚光镜性能的主要指标，通常用N.A表现。N.A=n.sinα/2(n为介质折光率，α为镜口角)。

　　21、辨别力辨别力是指显微镜能够分辩出的物体两点间Zui小间隔的才能。它与波长及物镜的数值孔径有关。

　　22、超净工作台利用过滤除菌的原理而设计出来的一种无菌操作工作台，鼓风机鼓出的空气通过孔径很小的薄膜将空气中的微生物过滤后变成无菌空气吹向操作台，可防止四周有菌空气流入，能保证操作台始终坚持无菌状况，便于无菌操作。

　　23、纯培养技术纯培养技术是培养某个单一微生物的方法。包含培养基的制造与灭菌。单一微生物的分离与纯化,和无菌操作接种技术。

　　24、焦深焦深是指清楚的目标象的上面和下面所看见的物象之间的间隔。它与放大倍数成反比，即放大倍数越大,焦深越小。

　　25、暗视野显微术利用暗视野聚光器能禁止光线直接照耀标本，而使光线斜射在标本上。在显微镜中见到黑暗视野中明亮物象的镜检技巧。

　　26、荧光显微术以紫外光作光源的显微镜检技术。

　　27、负相差在黑暗视野中看到明亮物体的相差镜检技巧。

　　28、正相差在明亮视野中看到黑暗物体的相差镜检技巧。

　　五、问答题

　　1.试述在普通光学显微镜下测定微生物细胞大小的根本办法。

　　测定微生物细胞的大小重要应用目镜测微尺。其方法如下:

　　先用长度已知的镜台测微尺校订目镜测微尺。校订的方式是让台尺与目尺重叠,看台尺的X格正好与目尺的Y格重叠，然后用盘算目尺每格的长.分辨校订目镜测微尺在低倍镜,高倍镜及油镜下每格所代表的实际长度。

　　将待测微生物制成水浸片或染色涂片置载物台上，调焦找到微生物后用目镜测微尺丈量其宽几格，长几格,然后乘上相应放大倍数下的校正值。

　　一般测10个微生物，然后以均匀值表现。

　　若是酵母、细菌等单细胞微生物,通常测其宽和长，然后以均匀宽´均匀长表现,单位为μm。

　　2、以测苏云金杆菌产业菌粉中的活菌数为例，试述稀释平板计数的基础办法。

　　（1）.测数前先筹备好测数用的1ml无菌吸管,9cm无菌平皿，9ml试管无菌水和牛肉膏蛋白胨琼脂造就基。

　　(2).称取10克产业菌粉参加90ml无菌水中置摇床上或用手振荡20-30分钟，让菌体疏散。

　　将上述振荡过的菌液按无菌操作法进行十倍稀释直到10-8。

　　取9cm无菌平板皿9套用记号笔在平皿底编号，10-8编3套，10-7编3套，10-6编3套。

　　用1支1ml的无菌吸管，取1ml10-8的稀释菌液放入编号10-8的平皿中，如此将三个反复做完。同法取10-7稀释菌液放入三个编号为10-7平皿中。同法取10-6稀释菌液放进三个编号为10-6平皿中.(均要按无菌操作法做)。

　　将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基融化冷至45-50℃后，在酒精灯火焰边按无菌操作法倒入上述9套平皿中，每个加入量大约15-20ml，边加边动摇平皿,，使培养基与菌液充足混匀。

　　待培养基凝固后,将平板倒过来，置28-30℃下培养48小时后计数。

　　3、试述划线分别的操作方法。

　　1. 取9ml无菌平皿一套在火焰旁按无菌操作法倒人15-20ml营养琼脂，让其冷凝成平板。

　　2.左手拿上述平板,右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取原始分离物在平板上平行划线三条。

　　3.将接种环在火焰上灭菌,左手平板转动大约70度，用灭菌接种环通过第一次划线的处所作二次划线，亦划三条。

　　同上法再作第三次,，第四次划线。

　　盖上平板盖，将平板倒过来置28-30℃下培养2-4天后察看成果。划的好应在第四次划线处呈现单个菌落。

　　注:本答案也可画图阐明。

　　4、如何检讨细菌的活动性?

　　检讨细菌的活动性有两种方法:

　　镜检法

　　将待检样品制成菌悬液,滴一点菌液于一盖玻片上，取一凹窝载玻片，将凹窝对准菌悬液盖在盖玻片上，然后将盖玻片和载玻片一起翻转，让菌悬液在凹窝上的盖玻片下。然后在显微镜下察看，观察应找悬液的边沿，因细菌为了更多地接触空气，总向水滴的边沿运动。视察时要注意将细菌的运动与分子的布朗运动差别开。

　　半固体穿刺法

　　将待检细菌穿刺接种在半固体试管培养基中,若细菌仅沿穿刺线生长,解释细菌不活动。若细菌沿穿刺线向四周扩散生长,阐明细菌有运动性。

　　5、简述配制培养基的基本原则:

　　培养基是人工配制的供不同微生物生长滋生，或用于积聚代谢产物的营养基质。所以配制培养基时应注意以下原则：

　　1. 依据微生物的不同选用不同的培养基，以满足微生物对营养物的须要。如自养型微生物所请求养分较简略，而异养型微生物营养请求较庞杂。培养细菌，放线菌，真菌等各有不同的培养基。

　　2. 注意各种营养物质的浓度与配比。微生物生长所须要的营养物质往往在恰当时才生长良好。浓度大往往会克制微生物的生长。如糖类，各种重金属盐类假如浓度太高，也会影响微生物的生长。同时各种营养物质的浓度比也应注意，特殊是C/N比。

　　3. 注意将培养基的pH值把持在必定范畴内。为了防止因微生物生长滋生或积聚代谢产物后影响培养基pH值，常在其中加入磷酸盐，碳酸盐，以保持培养基pH值的相对恒定。

　　同时还应斟酌培养基的氧化还原电位及原资料的经济、易购和起源普遍的原则。

　　6、试述配制培养基的根本进程及应当注意的问题。

　　配制培养基的根本进程是:

　　按培养基的配方称取各种药品，用量太少的药品应配制成溶液后再取必定量参加。

　　将各种药品加水溶解，通常是加所需水量的一半。

　　若配固体培养基，按2%的用量称取琼脂，用水将琼脂浸湿一下，用手挤往琼脂中过多的水分，加进2的溶液中。

　　加热至琼脂全体溶解，并补足所需的全部水量。

　　用1molNaOH和1molHCL调节pH至请求值。

　　用分装器将培养基分装进试管或三角瓶中，塞上棉塞并包扎，灭菌后备用。

　　注意事项:

　　配制进程中，在加热融化琼脂时，要不断搅拌，以防糊底。

　　分装时不要让培养基感染试管口或瓶口，以防培养过程中轻易污染杂菌。

　　7、试述显微计数的基础方式。

　　显微计数通常用来测微生物单细胞的数量，大一点的细胞如酵母菌用血球计数板，小一点的细胞如细菌用细菌计数板。该测数方法不能差别死活细胞，测出的是微生物总的细胞数目。

　　血球计数板和细菌计数板结构类似，计数区的面积都是1mm2，两者的差异在于血球计数板的深度为0.1mm。细菌计数板的深度为0.02mm。无论是血球计数板还是细菌计数板计数区都划为25个慷慨格，每个大方格又划为16个小格。所以每小格的体积为1/4000mm3或1/20000mm3。

　　计数时,先在显微镜下找到计数区，然后将菌液稀释到恰当浓度，取少量菌液滴在计数区上盖上特制盖玻片，亦可先盖盖玻片。然后用吸管将菌液从计数板上的沟里加入。靠菌液的表面张力充斥计数区。

　　计数时采用五点取样法数数，即四角各取一个大方格，再在中心取一个慷慨格。计数时慷慨格四周压线的细胞只数两边，以防增添数目。

　　将5个大方格的菌数加起来除以80得出每个小格的菌数，再乘以4000即为1mm3的菌数，再乘上1000即为1ml的菌数，乘上稀释倍数即为样品含菌数。

　　8、标本片上的某一物象，第一次看到后如何再次找到它?

　　要做到这一点，首先取决于显微镜的好坏，若显微镜上的推进器带有纵横标尺，很轻易做到这一点。首先记住标本片放到推动器上的方向，然后记下视察某一物体时推动器上的纵横标尺的数字。如纵3，横4。

　　当标本片拿下来后，若要反复察看本来的物象，只要按原方向将标本片荚在推动器上，将推进器推进到第一次观察该物体的纵，横标尺数字纵3，横4，即可看到第一次视察过的物体。

　　9、试述在光学显微镜下所看到的Anabaenaazotica的重要特点。

　　Anabaenaazotica的重要特点是:

　　菌体为丝状体，营养细胞为绿色，藻丝不扭曲。

　　该菌有异型胞,异型胞间生，无色透明，两端有极点。

　　厚壁孢子无色、大、两端无极点。

　　10革兰氏染色反映的成败要害是什么?为什么革兰氏染色有十分主要的理论与实践意义?

　　因通过革兰氏染色，可把几乎所有的细菌都分成G＋和G－菌两大类细菌，在细胞构造、成分、形态、生理、生化、遗传、免疫、生态和药物敏感性等方面都浮现出显明的差别。因此，任何细菌只要通过革兰氏染色，即可供给不少主要的生物学特征方面的信息。

　　革兰氏染色反响的成败要害是:

　　菌龄:12-24小时的纯培养物。

　　革兰氏染色操作时，要严厉把持酒精脱色时光，菌液涂布均匀而薄。

　　培养基的组成。

　　11、如何从土壤中分别得到一个微生物的纯培养体?

　　首先要根据分离对象选择合适的培养基。若要分离真菌应选用马丁-孟加拉红选择培养基；若要分离细菌应选用牛肉膏蛋白胨培养基；若要分离放线菌应选用高氏培养基。

　　土样采回来后，用惯例的十倍稀释分离法进行稀释分离，若分离细菌，一般稀至10-8,若分离放线菌,一般稀至10-6；若分离真菌，一般稀至10-4。取Zui后三个稀释度倒平板获得单个菌落。

　　将平板上呈现的单菌落转接斜面培养，同时镜检菌体的纯度，若不纯，应将培育的单菌落斜面再次进行稀释分别。倒平板获得单菌落，转接斜面培养，同时镜检菌体的纯度。重复几次直到得到菌体单一的单菌落方可以为是某一微生物的纯造就体。

　　12、察氏培养基的组成为:蔗糖:30克,磷酸氢二钾:1.0克,硝酸钠:2克,硫酸镁0.5克,氯化钾:0.5克,硫酸亚铁:0.01克,蒸馏水:1000ml.试述:

　　该培养基的C源,N源各是什么物资。

　　除C源和N源外的其它物质起什么作用:

　　该培养基为什么不加生长因子?

　　该培养基的C源物质是蔗糖，N源物质是硝酸钠。

　　1. 磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁为该培育基供给矿质养分。蒸馏水供给水分。

　　2. 该培养基培养的微生物在培养基上能合成自身所需的全体生长因子，故无需添加生长因素,该培养基所培养的微生物为野生型。.


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