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　　六、Caspase-3活性的检测 　　 Caspase家族在介导细胞凋亡的进程中起着非常主要的作用，其中caspase-3为要害的履行分子，它在凋亡信号传导的很多道路中施展功效。Caspase-3正常以酶原（32KD）的情势存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，终极导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和逝世亡细胞，caspase-3的活性显明降落。　　1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。　　方法：　　收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反响1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标志的羊抗鼠IgG或AP标志的羊抗鼠IgG室温反映1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。　　成果：[图9-1、图9-2]　　2 荧光分光光度计分析　　原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。依据这一特色，设计出荧光物资偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后开释出AMC，自由的AMC才干被激发发射荧光。依据开释的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反应Caspase-3被活化的水平。　　方式：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）?37°C反映1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。　　成果：[图10]　　3 流式细胞术剖析　　办法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?37°C反响1h?UV流式细胞计剖析caspase-3阳性细胞数和均匀荧光强度。　　结果：[图11] screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=176 title="Click to view full 8.jpg (687 X 189)" border=0 align=absmiddle>

　　图9－2 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=563 height=199 title="Click to view full 8'.jpg (563 X 199)" border=0 align=absmiddle>

　　图10－－ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=397 title="Click to view full 9.jpg (742 X 461)" border=0 align=absmiddle>

　　图11－－ （缩略图，点击图片链接看原图）

　　七、凋亡相干蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位剖析 　　TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功效研究表明，它是增进细胞凋亡的加强剂。应用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡进程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发明，凋亡早期TFAR19表达水平增高并呈现快速核转位现象，随同着细胞核形态学的变更，连续较长时光，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发明，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片断化，提醒TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期产生的事件之一。进一步的研讨证实，凋亡早期TFAR19的核转位具有广泛意义，不同细胞凋亡早期均涌现TFAR19高表达和核转位。这为研讨细胞凋亡早期所发生的事件，供给了一种新的技巧和指标。　　（一）TFAR19蛋白的细胞定位分析　　资料试剂：FITC标记的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。　　仪器：低温水平离心机, 37°C水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计　　方式：　　1 悬浮细胞的染色：　　（1）收获正常和引诱凋亡的细胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。　　（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。　　（3）加进PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。　　（4）加进200ml胎牛血清，室温反响30min。　　（5）加进5ml FITC标志的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4°C反应30min　　（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm′10min。成果察看：将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下察看TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的均匀荧光强度。[图12]　　2：贴壁细胞的原位染色　　（1） 贴壁生长的对数期细胞展在24孔或6孔板中（内有干净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡引诱剂处理细胞。　　（2） 将不同时光点处置的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。　　（3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜视察TFAR19在细胞中的定位。　　结果视察：[图13]　　3：临床病理切片的染色、检测。　　4：原代细胞的培育、检测。　　5：分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的散布及定位　　（二）TFAR19蛋白的表达与临床疾病　　1． ELISA法检测正凡人和疾病状况下，以及疾病的不同时代，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。　　资料和试剂：　　1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer　　2. 洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20　　3. 封闭液： 3%BSA（用洗涤液配制）　　4. 酶标抗体的稀释：用封闭液稀释　　5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g柠檬酸 0.51g DDW 100ml　　6. 显色液（现配现用）：底物Buffer 10mlOPD 2mg30% H2O2 2ml　　7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA Reader（OD490nm），洗板机 　　操作步骤　　1. 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C过夜（一般24h以上）。　　2. 洗涤Buffer洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C过夜。　　3. 洗涤Buffer洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3个反复孔）100ml/well ，37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对比。　　4. 洗涤Buffer洗板三次，参加1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。　　5. 洗涤Buffer洗板三次，参加显色液，100 ml/well，避光反映10~15min。　　6. 加入H2SO4终止反应，50 ml/well。　　7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比拟病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达程度。　　2． Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=479 height=317 title="Click to view full 11.jpg (479 X 317)" border=0 align=absmiddle>

　　图13－－ （缩略图，点击图片链接看原图）

　　真的不错，谢谢！！！！

　　受益非浅！非常感激！

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　　请教midas：我筹备检测神经细胞凋亡，请您具体先容一下各种方法的特色，如检出率、破费，哪种办法比拟合适研讨生做等，多谢！

　　我要乐疯了，感激主人！！

　　有一个迷惑的问题：在我看来，细胞流式仪检测凋亡既可以定性又可以定量，那为什么尽大多数试验室仍要同时用TUNEL法来进行定性呢？而且，现在对于TUNEL法检测凋亡存在必定的争议：并不是只有产生凋亡的细胞表示TUNEL（＋）。那么对细胞凋亡的检测是否只需细胞流式仪就足够了呢？

　　太信服主人了！既有程度又有高贵的品德，我要向您们学习！

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　　请问hoechsts33258和hoechst33342有什么不同？是不是33342主要用于悬浮细胞，而hoechst33258重要用于贴壁细胞？如果我用hoechst33258和PI做双标，应当怎么办特殊是 细胞怎么处置？谢谢

　　dinki wrote:有一个迷惑的问题：在我看来，细胞流式仪检测凋亡既可以定性又可以定量，那为什么尽大多数试验室仍要同时用TUNEL法来进行定性呢？而且，现在对于TUNEL法检测凋亡存在一定的争议：并不是只有产生凋亡的细胞表示TUNEL（＋）。那么对细胞凋亡的检测是否只需细胞流式仪就足够了呢？我以为：由于目前除了电镜是检测凋亡的金尺度外，其他的方式均有必定的不足，所以一般都会用到两种以上的方法对细胞调亡进行检测，如：流式＋荧光染色，荧光染色＋DNAladder等等。TUNEL的方法是体内实验时检测调亡的常用办法，而流式对体内细胞的调亡则无能为力。

　　jchenone wrote:请问hoechsts33258和hoechst33342有什么不同？是不是33342重要用于悬浮细胞，而hoechst33258重要用于贴壁细胞？假如我用hoechst33258和PI做双标，应当怎么办特殊是 细胞怎么处置？谢谢hoechsts33258，hoechst33342二者差别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！这么说来，假如您用hoechst和PI做对活细胞进行双标，那么就Zui好选择hoechst33342，这是就可以直接将染料参加培育液中，之后固定察看；但是假如必定要用hoechsts33258，那么就Zui好是：固定－－>染色－－>视察。

　　我Zui近的实验很不顺，我将载玻片用左旋多聚赖氨酸包被后放与六孔板中，但是很轻易污染，不知各位高手有何高招．

　　XSQ wrote:我Zui近的试验很不顺，我将载玻片用左旋多聚赖氨酸包被后放与六孔板中，但是很轻易污染，不知各位高手有何高招．载玻片、PLL、六孔板、造就液及玻片确保无菌，Zui主要的无菌操作技巧！

　　讲的太出色了，好！

　　好极！我要做原代非决裂细胞的凋亡检测，不知主任有没好的建议，还有，不知哪位高手做过Sertoli Cell的原代培育，很想请教！

　　请问caspase-3导致细胞凋亡的具体进程是怎样的？

　　细胞凋亡的图片1电镜 （缩略图，点击图片链接看原图）

　　细胞凋亡的图片2电镜 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=190 height=250 title="Click to view full apop5扫描电竟.gif (190 X 250)" border=0 align=absmiddle>


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