显微镜,显微镜价格,显微镜的价格

　　※营养卫生食品科学2006, Vol. 27, No. 09 241

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　　收稿日期：2005-10-26

　　基金项目：江苏省教导厅自然科学研究项目(01KJD310003)；江苏大学高等人才启动金项目(05JDG024)

　　作者简介：杨小明( 1 9 6 3 - ) ，女，副教授，博士，研究方向为自然产物有效成分的提取及活性研究。

　　银杏中银杏酸诱导人白血病细胞U937

　　凋亡的研究

　　杨小明1 , 3，陈永昌2，陈 钧3，谢吉民1

　　(1.江苏大学化学化工学院，江苏 镇江 212013；2.江苏大学医学院，江苏 镇江 212002；

　　3. 江苏大学生物与环境工程学院，江苏 镇江 212013)

　　摘 要：目标：研究银杏酸体外对U937 细胞生长的抑制作用，探讨其作用机理。方式：采用MTT 法检测银杏

　　酸对U937 细胞增殖的影响，激光共聚焦显微镜察看细胞形态的变更，DNA 琼脂糖电泳检测其生化特点的转变，流

　　式细胞仪剖析细胞凋亡率。成果：U937 细胞经银杏酸作用24～48h，细胞的生长显明被克制；银杏酸作用28h 出

　　现了细胞皱缩、核浓缩、体积缩小等显着的凋亡的形态学特点；细胞D N A 经琼脂糖电泳可见典范的梯形条带；

　　10.0μg/ml 的银杏酸作用40h 后，细胞凋亡率为14%。结论：银杏酸对U937 细胞具有明显的抗肿瘤活性，其作用

　　机理与诱导细胞凋亡有关。

　　要害词：银杏酸；U 9 3 7 细胞；凋亡；M T T

　　Apoptosis Study on Human or Leukaemia Cell Line U937 Induced by Ginkgolic Acids from Ginkgo biloba L.

　　YANG Xiao-ming1,3，CHEN Yong-chang2，CHEN Jun3，XIE Ji-min1

　　(1.School of Chemistry and Chemical Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；

　　2.School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212002, China；

　　3.School of Bio-environment Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

　　Abstract ：To investigate the inhibition effects of ginkgolic acids on U937 cells in vitro and its anti-tumor mechanism. Method:

　　The growth inhibition effects of ginkgolic acids on U937 cell were assayed by MTT method. Changes of U937 cell morphologic

　　character were observed under laser focusing microscope. Bio-chemistry characteristics of cell apoptosis was observed by DNA

　　agarose electrophoresis. Apoptosis rate of U937 was analyzed by FCM. Result: Ginkgolic acids shows obvious inhibiting effect

　　on cell growth after culturing U937 cell with it for 24～48h. Exposure U937 cell to ginkgolic acids for 28h, that ginkgolic acids

　　make the U937 nucleolus shrink in volume, darken in color, distort in shape. U937 cells show morphologic characteristics of cell

　　apoptosis. U937 cell DNA appeare DNA ladder type in agarose electrophoresis. Exposing U937 cell to 10.0μg/ml ginkgolic acids

　　for 40h, the apoptosis rate is 14%. Conclusion: Ginkgolic acids show an anti-tumor activity through inducing apoptosis in

　　tumourcell.

　　242 2006, Vol. 27, No. 09 食品科学※养分卫生

　　Key words：Ginkgolic acids；U937 cell；apoptosis；MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-z-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium

　　Bromide)

　　中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2006)09-0241-06

　　银杏酸(Ginkgolic acids，GAs)存在于银杏(Ginkgo

　　biloba L.)的叶、果和外种皮中，在未经特别处置的银

　　杏叶提取物(EGb，Extract of Ginkgo biloba)中，银杏酸

　　的含量一般为(600～1500)× 10－ 6，Zui高可达1%显微镜左右。

　　国内和日本市场上销售的银杏茶中，银杏酸的含量也高

　　达0.27%～1.18%[2,3]。银杏酸是6- 烷基或6- 烯基水杨酸

　　的衍生物，六位上的侧链碳原子数可从13 至19，侧链

　　双键数可为0 至3 个，为一同系物的混杂物(见图1)。银

　　杏酸被以为具有皮肤致敏作用及细胞毒性，因此银杏叶

　　提取物中被限量在5 × 10－ 6 以下荧光显微镜。研究发明，银杏酸

　　具有抑制肿瘤细胞生长的作用[4 ～7]，但其抑制机制至今

　　尚未见报道。为进一步研究银杏酸对肿瘤细胞的影响，

　　我们以U937 细胞为试验瘤株，探讨银杏酸对U937 细胞

　　生长抑制造用的可能机制，为进行新药开发供给基本。

　　四氮唑蓝(MTT)、蛋白酶K 、碘化丙啶(PI)、R N A 酶

　　Sigma 公司；溴化乙啶(EB)、吖啶橙(AO) Fluka 公司

　　分装；DMEM 培养基、小牛血清 Gibco 公司；二甲

　　基亚砜(DMSO，Acs Grade) Amresco 分装；SDS 南

　　京生兴生物技巧有限公司；低熔点琼脂糖、正常熔点琼

　　脂糖 Spanish分装；Triton X-100 Amresco分装；Tris

　　Base(Molecular Biology Grade) Promega Corporation；柱

　　层析用硅胶G(100～140目) 上海化学试剂公司；其余

　　试剂均为分析纯。

　　银杏酸对照品1 由德国Schwabe 公司H.Jaggy 博士

　　赠予，纯度9 9 % 以上。

　　银杏酸对照品2 中国药科大学，单体C13:0 银杏酸纯

　　度9 5 % 。

　　银杏外种皮采收于江苏大学校园，晒干后密封保

　　存。

　　1.1.3 细胞株 U937细胞 上海细胞所，由江苏大学

　　医学技巧学院保留。

　　1.2 办法

　　1.2.1 银杏酸的制备和纯度测定

　　将银杏外种皮剪碎后，按1:5 的比例加入石油醚(沸

　　程60～90℃)超声萃取1h，过滤，滤渣反复提取两次，

　　合并提取液，挥往石油醚得浸膏。浸膏用少量石油醚

　　溶解后，加样于硅胶柱上(硅胶120g，φ 32 × 400mm 玻

　　璃柱，湿法装柱)，石油醚- 乙醚- 甲酸(89:11:1，V/V/

　　V)洗脱，以GF254 薄层层析(展开剂为石油醚- 乙醚- 甲酸,

　　70:30:1)在254nm处出现蓝紫色荧光为监测，收集银杏酸

　　组分，浓缩至干；反复过柱，得到的银杏酸组分水洗

　　至中性，无水N a S O 4 干燥后，挥往溶剂，得银杏酸同

　　系混杂物。

　　银杏酸的确认及纯度测定参见文献Nikon，分析色谱

　　工作条件：流动相为甲醇-3% HAc 溶液(92:8，V/V)，

　　流速1.0ml/min，柱温40℃，紫外检测波长310nm。

　　1.2.2 细胞培育

　　U937 细胞采取DMEM 培育液，内含10% 小牛血清、

　　1 × 105U/L 青霉素和125mg/L 的链霉素，惯例传代，置

　　37℃、5% CO2 培养箱培养。

　　1.2.3 银杏酸对U937 细胞生长的影响

　　银杏酸以D M S O 配制成不同浓度溶液备用。

　　取对数生长期的U937 细胞，配制成5 × 104/L 的单

　　细胞悬液，分装于96 孔造就板中，每孔200μl ，同时

　　加入2μl 含不同浓度银杏酸的D M S O 溶液，培养液中

　　图1 银杏酸构造图

　　Fig.1 Structure of Ginkgolic acids

　　C O O H

　　O H

　　R

　　R=C13H27(C13:0)，R=C15H31(C15:0)

　　R=C15H29(C15:1)，R=C17H33(C17:1)

　　R=C17H31(C17:2)

　　1 资料与方式

　　1.1 资料

　　1.1.1 仪器

　　μQuant MQX200 酶标仪 Bio-TEK Instruments

　　INC；Radiance 2100激光共聚焦显微镜 Bio-Red公司；

　　FACSC alibur 流式细胞仪 Becton Dickinson 公司；

　　Nikon Eclipse TE300 荧光显微镜；HITACH 高速离心

　　机；程度电泳槽及DYY-6B 型稳压稳流电泳仪；Alpha

　　凝胶成像体系；Mettler AE240 型电子剖析天平；1810B

　　型主动双重纯水蒸馏器，MM-1 微型混和器，HH 恒温

　　水浴锅。

　　LC-1500 高效液相色谱仪 日本JASCO 公司；

　　1575UV/VIS 紫外检测器；分析色谱柱：HiQ SiL C18(4.6mm

　　× 250mm，5μm) KYA TECH Corporation。

　　1.1.2 试剂

　　丝裂霉素C(MMC) Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd.；

　　※营养卫生食品科学2006, Vol. 27, No. 09 243

　　D M S O 含量不超过0 . 1 % 。细胞对照组用D M S O 取代银

　　杏酸，空缺组用D M E M 取代细胞悬液和银杏酸，各组

　　设6 个平行孔，置37℃培养24、36、48h，实验终止

　　前4h 参加10μl 5mg/ml 的MTT 生理盐水溶液，持续培

　　养4 h ，弃上清液，加入D M S O ，充足振荡待孔内结晶

　　溶解后，用空缺调零，置于490nm 波长酶标仪测定A490

　　值，按下列公式求诞生长克制率。

　　生长抑制率IR(%) = (1－用药组A490 值/ 对照组A490

　　值)× 100%

　　1.2.4 单细胞凝胶电泳检测

　　实验基础按参考文献[ 9 ]办法进行。电泳停止后，

　　EB 染色，在荧光显微镜下每张电影随机视察50 个细胞

　　(2 张/ 组)，彗星拖尾长度在Photoshop 7.0 图象处理系

　　统中进行计数。在放大200 倍的图片中，以同样亮度为

　　彗星中心，作彗核心，记载坐标( X 1 ，Y 1 ) ；亮度R e d

　　200 作为慧核心的边沿，记载慧核心边坐标(X2，Y 2) ；

　　以亮度Red5 为彗星尾的终点，记载慧尾坐标(X3，Y3)。

　　彗星头长=2×彗星核半径 = 2×[(X1－X2)2 + ( Y1－

　　Y2)2]1/2；

　　彗星核到慧尾长=[(X1 － X3)2 + (Y1 － Y3)2]1/2；

　　慧尾长= 彗星核到慧尾长－彗星核半径；

　　每实验组共记数50 个拖尾细胞，盘算均匀彗星头

　　长和拖尾长度，单位以像素计。

　　并盘算各组DNA 断裂细胞的百分率。用SAS8.2 软

　　件进行方差检验。

　　1.2.5 激光共聚焦显微镜视察

　　将对数生长期的细胞移进24 孔板中，培育24h 后，

　　在其中参加浓度为10.0μg/ml 的GAs 溶液，以0.1% DMSO

　　为阴性对照，持续造就28h 后，加0.1% 吖啶橙生理盐

　　水溶液10μl，于37℃造就箱中避光染色20min 后，用

　　P B S 洗去过剩染液，滴片，上机分析。

　　1.2.6 D N A 凝胶电泳分析

　　U937 细胞经不同浓度的GAs 作用24h 后，1000r/min

　　离心1 0 m i n 收集各组细胞，用冷P B S 洗两次，加入

　　裂解液500μl(Tris-HCl 10mmol/L，EDTA10mmol/L，NaCl

　　150mmol/L，0.4% SDS)，2.5μl，20mg/ml 蛋白酶K

　　37 ℃过夜，分辨用平衡酚、氯仿: 异戊醇(24:1) 抽提

　　6000r/min 离心10min 分别，上清液参加2 倍体积冷乙醇

　　充足混匀后12000r/min离心10 min，倾往上清液，用75%

　　冷乙醇洗涤沉淀，晾干后T E 液溶解，以1 . 5 % 琼脂糖

　　电泳，E B 染色，紫外线下察看照相。

　　1.2.7 流式细胞仪检测D N A 含量

　　分辨收集药物处置组和对照组的细胞，用预冷的

　　PBS 洗两次，滴进4℃预冷70% 乙醇中，于4 ℃固定过

　　夜。弃固定液，细胞用P B S 漂洗2 次，加入R N a s e 、

　　37℃水浴30min。水浴后立即放入冰块中，以结束RNase

　　的作用。加入PI 染色液混匀，在4℃避光40min。400

　　目标筛网过滤后上机测定。低于G1 期DNA 含量的细胞为

　　凋亡细胞。计数10000 个细胞测定各期DNA 含量，盘算

　　凋亡细胞百分率和察看凋亡峰。试验成果采取SAS 8.2 软

　　件进行方差检验。

　　2 结果与分析

　　2.1 银杏酸的制备和纯度测定

　　银杏外种皮经石油醚提取得到粗提物。粗提物经硅

　　胶柱层析，收集到的银杏酸经TLC 检测为单一斑点。经

　　多次柱层析，所得银杏酸同系混杂物经HPLC 外标法测

　　定其纯度90% ，按面积回一法测定其重要组成为C 1 3 : 0，

　　20.7%；C15:1，51.6%；C17:1，21.1%；C17:2 和C15:0 各为

　　3.3%。

　　2.2 银杏酸对U937 细胞生长的抑制造用

　　银杏酸对U937 细胞生长浮现显着的抑制作用，见

　　图2 。在同一作用时间内，随着银杏酸浓度的增大，抑

　　制造用加强，当银杏酸浓度增添到50μg/ml 时细胞生长

　　抑制率到达Zui大，24h 时抑制率为61%，48h 时为79%；

　　此后再增添浓度，细胞生长的抑制率反而下降。而同

　　一药物浓度，作用时光越长，生长抑制率越高。

　　24h

　　36h

　　48h

　　100

　　80

　　60

　　40

　　20

　　0

　　5 10 30 50 100

　　细胞生长抑制率(%)

　　银杏酸浓度(μg/ml)

　　24h

　　36h

　　48h

　　图2 不同浓度银杏酸对U937 细胞生长的影响

　　Fig.2 The effect on growth of U937 cell by different concentration

　　ginkgolic acids

　　2.3 银杏酸引诱U937 细胞DNA 链断裂

　　在显微镜下细胞D N A 呈桔红色，正常细胞

　　D N A 呈圆形，损伤细胞D N A 发生链断裂，断片朝阳极

　　迁移，形成彗星样的拖尾，呈梭形或放射状，见图3 。

　　溶剂对照(DMSO)组细胞大多未涌现DNA 迁移，而

　　表示为一个圆形的荧光头，少数细胞涌现拖尾，但彗

　　星尾长很短。而阳性对比组细胞全体呈现D N A 迁移，

　　其彗星尾长而宽。在同样条件下，用0.1～1.0μg/ml 的

　　银杏酸作用U937 细胞1.5h，其存活率未受明显影响。

　　实验结果显示，在作用剂量范畴内，银杏酸可不同程

　　度地引诱细胞D N A 链的断裂，与溶剂对比组相比，各

　　剂量组NDA 断裂细胞百分率及其DNA 迁移间隔均显明

　　244 2006, Vol. 27, No. 09 食品科学※养分卫生

　　增添，且浮现良好的量效关系，见表1 。

　　2.4 细胞的形态学观察

　　组别

　　浓度D N A 断裂细胞百分率拖尾长度

　　(μg/ml) (%) (像素，x ± s)

　　D M S O 1.0 13.2 6.90±3.33*

　　0.1 84.1 10.06±6.33*

　　GAs 0.5 100 10.80±6.97*

　　1.0 100 12.99±7.13*

　　M M C 4.5 100 14.76±6.89*

　　表1 GAs 对人U937 细胞DNA 的损伤

　　Table 1 DNA strand breaks in human U937 cell by ginkgolic acids

　　注：*p ＜ 0.01 vs DMSO 组。

　　图4 为在激光共聚焦显微镜下AO 染色的U397 细胞

　　D N A 的形态。图A 为D M S O 处理组的细胞，可见细胞

　　形态正常，核浮现均匀浅黄绿色荧光。图B 为经处置

　　组的细胞，10.0μg/ml 银杏酸作用28h 后，细胞质浓染、

　　核浓缩、体积缩小，并可见黄色碎片出现了凋亡细胞

　　特征性的形态学转变。

　　2.5 D N A 琼脂糖凝胶电泳

　　U937 细胞经0.1、1.0、10.0μg/ml 的银杏酸和

　　4.5μg/ml 丝裂霉素作用24h 后的DNA 电泳图形见图5。

　　未经药物处理的正常组细胞和经0.1μg/ml银杏酸处

　　理的细胞均未呈现显明的D N A “梯型”条带，也未观

　　察到坏逝世细胞DNA 的“带状”条带。浓度为1.0μg/ml

　　※营养卫生食品科学2006, Vol. 27, No. 09 245

　　和10.0μg/ml 的银杏酸作用于U937 细胞24h 后，琼脂

　　糖电泳出现明显的D N A “梯型”条带，大约相当于

　　180～200bp 的整数倍，提醒DNA 在核小体间断裂，呈

　　现细胞凋亡的典范特征。而高浓度银杏酸(≥ 1.0μg/ml)

　　能明显诱导U937 细胞的凋亡，与阳性组丝裂霉素一致。

　　2.6 细胞凋亡率的分析

　　流式细胞术分析结果表明：银杏酸可诱导U937 细

　　胞呈现亚G 1 峰，再次证实了D N A 凝胶电泳的结论：银

　　杏酸能诱导U937 细胞产生凋亡。见图6 。银杏酸诱导

　　细胞凋亡的作用呈剂量依附性，溶剂对比组，细胞凋

　　图6 流式细胞仪分析不同剂量银杏酸对U937 细胞凋亡的作用

　　Fig.6 Analysis the effect of different doses of ginkgolic acids on

　　U937 apoptosis by flow cytometer

　　A：Control ；B：GAs 0.1μg/ml；C：GAs 0.5μg/ml；D：GAs

　　1.0μg/ml；E：GAs 10.0μg/ml。

　　亡率约2.4%；实验组中，当银杏酸浓度为0.1、0.5μg/ml

　　时，细胞凋亡率分辨为3.3% 和4.4%，与对照组的凋亡

　　率发生了明显差别(p ＜ 0.05)；当银杏酸浓度为1.0 和

　　10.0μg/ml 时，细胞凋亡率到达11% 和14%。

　　3 讨 论

　　在肿瘤的治疗手腕中，化学药物的治疗是发展Zui快

　　的一个范畴，从自然产物中寻找抗肿瘤药物或先导物是

　　一条高效的道路。随着分子生物学的敏捷发展，人们

　　已将杀伤型细胞毒药物的发展策略转向针对新靶点、提

　　高选择性、探讨新的作用机理、寻找新型化学构造这

　　一方向。

　　有关肿瘤产生发展分子机制的研讨表明，在恶性

　　肿瘤细胞中，细胞内的各种基础进程均有调节失控。

　　这些进程包含：信号传递、细胞周期、细胞凋亡、

　　血管天生、端粒酶的稳固性以及胞外基质的相互作

　　用。

　　为研制出具有特异性的药物，研究者应用肿瘤细胞

　　246 2006, Vol. 27, No. 09 食品科学※养分卫生

　　分子生物学上的Zui新发现，将注意力转向肿瘤产生发展

　　进程中起作用的特异的分子及生物靶点，以追求新型抗

　　肿瘤药物。如细胞凋亡诱导剂、信号传导阻滞剂、血

　　管天生抑制剂。因此近年来有关自然产物与肿瘤细胞周

　　期和肿瘤凋亡关系的研究非常活泼。

　　杨小明等荧光显微镜研究发现银杏酸浓度≤ 5.0μg/ml 时，对

　　转化的正凡人肾脏293 细胞和小鼠NIH/3T3细胞的生长几

　　乎不产生影响；但对人肺癌LTEP-a-2、A549 细胞和白

　　血病U937 细胞生长均产生明显抑制作用，其中对LTEPa-

　　2 瘤株的抑制率达59.1%。

　　本实验采用人白血病U937 细胞为试验细胞株，观

　　察了银杏酸对其作用后形态、生化特征等各方面的变

　　化。以探讨其作用机制。

　　细胞凋亡过程中常随同有细胞形态的变更，形态学

　　变化是分析细胞凋亡的有效方式。本实验采用体外培

　　养，经特定染色后在激光共聚焦显微镜下进行视察，结

　　果显示经银杏酸10μg/ml 处理28h 后，U937 细胞出现皱

　　缩变形、体积缩小、核浓缩、并涌现黄色碎片等细胞

　　凋亡的典范形态变更特点。采取琼脂糖凝胶电泳技巧，

　　发明U937 细胞经1.0μg/ml 的银杏酸作用24h 后，其DNA

　　出现明显的“梯状”条带，表示出现细胞凋亡的典型

　　生化特征。通过单细胞凝胶电泳发现低浓度的银杏酸即

　　能造成U937 细胞DNA 链的断裂，产生断裂的细胞数目

　　与断裂水平与银杏酸的浓度呈正比。通过流式细胞仪分

　　析了凋亡率。

　　总之，银杏酸在低浓度时就能抑制U937 细胞等多

　　种肿瘤细胞的生长。1.0μg/ml 的银杏酸能诱导U937 细

　　胞的凋亡。可见银杏酸具有显着的引诱肿瘤细胞凋亡、

　　克制肿瘤细胞生长的作用。

　　银杏是我国特有的古老植物质源，其叶、果均可

　　进药。目前以银杏黄酮和内酯为药效成分的银杏叶提取

　　物及其制品已成为国际公认的预防、治疗心脑血管疾病

　　的天然植物药之一。本研究证实了银杏酸为银杏中的抗

　　肿瘤成分，为银杏资源的充足开发应用供给基本。

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　　信 息

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　　fef

　　科学家找到H5N1 禽流感病毒致命弱点

　　据路透社报道，科研职员发明 H5N1 病毒致命弱点，由此可研制新来抵抗病毒在人与人之间传布，伦敦国度

　　医药研讨机构约翰·斯凯海尔引导的科研小组说，他们已经在 H5N1 病毒体内找到了某一腔室，或者说是一种神

　　经氨酸酶，这有可能就是病毒潜在致命弱点。斯凯海尔告知路透社记者说：“这个新讯息给我们带来了盼望，对

　　付 N1 神经氨酸酶的殊效药可以研发 成为抗衡H5N1 型病毒的新药物。”

　　研讨成果发表在《自然》上，文中写道：“剖析表明，我们有可能断定1 号腔室的大小和具体方位，而这

　　有助于研发新一代抗沾染药物。”但任何新药物的研发都须要数年时光，斯凯海尔坦言：“这可不是一挥而就的事

　　情。很可能要破费五六年时光。”

　　有一些国度已经开端储备Tamiflu 和Relenza，但由于H5N1 型 病毒经常性变异，上述药物难以禁止在人际间传

　　染。斯凯海尔说：“现在有一系列的抗病毒药物，有一些是专门对付H5N1 型病毒的，也有像Tamiflu 和Relenza

　　那样抗衡其他N 病毒的，尤其对N1 有宏大药效。但这些药物都无法禁止病毒变异，不过值得庆幸的是它们可以控

　　制病毒发生抗药性。这就像人类和病毒之间的赛跑。你必需领先于病毒的变异速度，特殊是要比H5N1 型能直接在

　　人类沾染前达到终点。”


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