光程不相等问题分析

比耳定律假设所有入射光线通过相同数量的吸收粒子或假设所有入射光线通过吸光物质的光程相等。其实不然，如果把一个样品放在几台不同的紫外可见分光光度计上测试，尽管仪器都经过认真的调试、校验，但其测试结果是不会相同的。原因是多方面的，除前面所述因素的影响外，还有以下因素引起光程的变化，导致产生误差。

①光束倾斜。

一般来讲，从单色器出来的光照射到比色皿的时候，不可能是理想的平行光，总有一个孔径角，因此，通过比色皿的平均光程总是大于垂直通过的光程长度。研究表明，当孔径角小于5度时，吸光度A的误差小于0.1%。

②比色皿引起的误差。

大多数样品是以溶液形式进行分析测量的，因此，比色皿就成了重要部件。它的几何尺寸的加工误差、配对误差会直接导致分析测试结果产生误差。特别是比色皿的两个通光面之间的距离和平行性，更是如此。英国标准研究所曾经介绍过关于比色皿的技术要求。他们建议光程长的标准精度必须达到±0．02mm，端面窗的平行性是每厘米4个光圈（用汞灯的546. 1nm测试），对于1Omm光程的比色皿，其标定精度必须在±0．01mm内。
根据我国国家计量检定规程的要求，对我国某公司生产的比色皿进行过测试。在三个月中（其中间隔一个月），先后从两批产品中挑选62对比色皿进行了配对检测。第一批挑选32对比色皿，不合格者达22对，占68. 8%。第二批挑选30对比色皿，不合格者23对，占76. 6%。而该公司长期从事比色皿的生产，用户遍布全国各地，甚至大量出口国外。据该公司负责人讲，从未听到过使用者对他们生产的比色皿提出过配对不合格的意见。这说明了广大科技人员尚未对比色皿的配对误差给紫外可见分光光度计的分析误差带来的严重影响引起重视。

③样品处理和测量过程中产生的误差。

不管测试什么样品，总是要事先对样品进行处理。而对样品进行处理，总会因为仪器设备等各种原因而带来误差。例如，称量天平的误差，取液的量筒或移液管等玻璃仪器的误差，仪器条件选择（如光谱带宽、扫描速度等）、环境因素（如温度、电磁场的干扰等）、人为操作误差等。这些误差都会引起比耳定律应用的可靠性问题。
以上论述了光吸收的光学类分析仪器的理论基础。即使是Zui简单的滤光片式的光吸收的光学分析仪器（如核酸蛋白分析仪器、酶标仪、721等可见分光光度计等分子光谱分析仪器），也必须遵守这些理论。如果想设计制造出优质的光吸收类光谱仪器（高档紫外可见分光光度计、高档原子吸收分光光度计、高档液相色谱光学类检测器等），就必须掌握与这些仪器相关的仪器学理论。