荧光显微镜之荧光激发块的选择

在生命科学领域，随着科研水平和实验手段不断的提高，荧光染色方法以其特异性强，使用相对于放射性元素更安全，检测越来越灵敏等特点，受到越来越多的研究人员的认可，并且在实验室中广泛应用，成为经常性的实验方法。
检测荧光方法和手段根据不同的实验要求和目的也多种多样，使用Zui多的还是荧光显微镜，荧光酶标仪，流式细胞仪等。但是，无论何种仪器，无论仪器的性能如何，要得到准确的实验结果，准确的实验数据，Zui基本的条件就是根据所使用的荧光染料正确设置激发和发射波长。
下面我们以荧光显微镜的荧光滤色镜为例，介绍一下滤色镜组的构造以及根据染料，如何正确选择滤色片。
荧光激发块是荧光显微镜中用来激发荧光标本和观察荧光的核心部件，它实际是滤色片的组合，一般含有3种滤色片:
1. 激发滤色片（Exciter Filter）：选择透过某个波段的光，来激发荧光染料。
2. 分色镜 （Dichroic Mirror）：反射激发光，透过荧光，一般激发光波长短，而发射光波长较长。
3. 发射滤色片(Barrier Filter) ：透过发射光，也就是我们看到的“荧光”。同时阻挡各种杂散光和激发光的反射光。

根据荧光观察的原理—荧光染料吸收特定波长的光（即激发光），跃迁到激发态，然后再释放出特定波长的发射光（即荧光），回到基态。由此可知荧光染料所需的激发光和释放的荧光都是特定波长的，所以需要利用各种滤色片来选择性的透过某种特定波长的光来实现荧光观察。否则，就会出现激发不了，激发了却看不到或串色的现象。所以选择合适的滤色片非常重要！
下面我们以荧光染料DAPI为例，阐述该如何选择荧光激发块。

通过上图，我们可以了解到DAPI的激发光波长为300nm-410nm左右，激发峰值在360nm左右，也就是说激发光在300-410nm时可以激发DAPI染料，在360nm时激发效率Zui高。发射光波长为390nm-600nm，峰值在470nm左右。接着，我们就根据这些数据来选择滤色片。

上图为Olympus U-FUW激发块的光谱信息。我们可以了解到此激发块可以提供的激发光波长在300-400nm之间，刚好可以激发DAPI。允许透过的荧光光谱范围也在410nm以上，所以此激发块可以用来实现DAPI荧光染料的观察。
让我们再来看一个激发块的光谱图：

上图为olympus U-FGW激发块的光谱信息，可以看出此激发块可以提供的激发光在530-560nm左右，允许透过的荧光光谱范围在570nm以上，所以此激发块并不适合DAPI激发。如果用此激发块来做DAPI的观察，就会出现看不到荧光的现象。
可见，要选择合适的荧光激发块，我们首先要知道荧光染料激发和发射光的波长特性和激发块光谱的各项数据。但是，荧光染料和滤色片的种类非常多，用户往往没有渠道来获取这些信息。在实际实验中使用荧光显微镜时，因为荧光激发块配置错误而得不到好的观察效果的现象经常发生，对于用户来说是一件非常烦恼的事。
为了方便用户正确选择激发和发射波长，节省时间，日本理化研究所脑科学所－奥林巴斯合作中心开发了软件Spectrum Manager。用户选择荧光染料，软件会给出染料的光谱信息和推荐的滤色片选择等信息，使用非常方便。

还可利用Data Manager自行对光源信息、染料数据库或滤色片信息进行更新。

此款软件已经整合至奥林巴斯共聚焦显微镜的一款软件中，发布以来得到了用户非常好的反响。由于是针对共聚焦显微镜的软件，所以软件中仅提供了激光光源谱线。如果您有需要，也可以将汞灯和氙灯光源信息导入至软件。
以下提供普通荧光显微镜常用的汞灯和氙灯光源的图谱，供大家参考。

汞灯在313, 334, 365, 406, 435, 546, 578nm有比较好的激发峰。

氙灯在可见光光谱范围内强度更稳定（没有像汞灯那样的光谱峰值），在红外波段比汞灯强度高。但在紫外波段有一定的缺陷性。
所以选择光源时，光源特性一定要与我们的具体应用相匹配。